מיקרוסקופיה דו-פוטונית לניטור דינמיקת סידן בקולטני אור של חרוט רשתית עכבר

תקציר

מקור: Kulkarni, M. et al. הדמיה Ca²⁺ דינמיקה במסופי אקסון קולטני אור חרוטים של רשתית העכבר. J. Vis. Exp. (2015)

סרטון זה מדגים את השימוש במיקרוסקופ דו-פוטוני לניטור דינמיקת סידן בקולטני אור חרוטים של רשתית עכבר טרנסגנית. הוא מתאר את השלבים להכנת פרוסות רשתית, הדמיית חיישני סידן מבוססי FRET וניתוח שינויים פלואורסצנטיים כדי לכמת את רמות הסידן תחת תאורת רקע וגירוי אור.

פרוטוקול

כל ההליכים הכוללים דגימות של בעלי חיים נבדקו ואושרו על ידי ועדת הביקורת האתית המתאימה לבעלי חיים.

1. הכנת פרוסות (10 - 15 דקות)
   1. הכן מראש ממברנות מסנן ניטרוצלולוזה לחיתוך רשתית וכיסויי זכוכית להרכבת פרוסות והעברתן לתא ההקלטה. חותכים את קרום מסנן הניטרוצלולוזה לחתיכות מלבניות בגודל של כ-10X5 מ"מ בעזרת מספריים. חותכים את הכיסויים לחתיכות מלבניות בגודל של כ-10X5 מ"מ בעזרת חותך זכוכית.
   2. טבלו לאט שקופית זכוכית בתמיסה החוץ-תאית הקרובה לרקמה. בעדינות, משוך את פרוסת הרשתית שהתקבלה מעכבר החיישן הביולוגי HR2.1:TN-XL Ca²⁺ אל מגלשת הזכוכית כשצד תא הגנגליון כלפי מעלה על ידי תפיסתו בקצה באמצעות זוג מלקחיים. תהליך זה מפחית נזק מכני וקיפול רקמות.
   3. בחר את אזור הרשתית הקשור לשאלת המחקר המתאימה. חותכים חתיכה מלבנית בגודל של כ-1X2 מ"מ מאזור הרשתית שנבחר באמצעות להב אזמל מעוקל. נגב עודפי תמיסה סביב הרקמה.
   4. הנח את קרום המסנן על גבי פיסת הרשתית כך שצד תא הגנגליון יידבק לממברנה. מיד, הוסף טיפה של מדיום חוץ-תאי על הממברנה כדי לחבר היטב את הרקמה לקרום.
   5. העבר את רקמת הרשתית המותקנת על הממברנה לתא החיתוך המכיל תמיסה חוץ-תאית טרייה.
   6. חתכו את הרשתית לפרוסות אנכיות בעובי של 200 מיקרומטר ( איור 1B) באמצעות סכין גילוח טרי שמחובר לקוצץ רקמות. החלף את הלהב עבור כל חלק ברשתית.
      הערה: סכין הגילוח צריך להיות מיושר בצורה מושלמת עם פני השטח של תחתית תא החיתוך כך שכל הממברנה תתפצל בו זמנית, כפי שמצוין על ידי צליל "לחיצה" בעת החיתוך. אחרת, הלהב עלול להתכופף ולפגוע בפרוסה.
   7. הדביקו פרוסה אחת המותקנת על הממברנה לכיסוי זכוכית על ידי מריחת גריז ואקום גבוה על קצוות הממברנה בלבד (איור 1C). שמור על משטח הזכוכית מתחת לרשתית נקי משומן.
   8. שמור פרוסות המותקנות על הכיסוי מכוסות בטיפת תמיסה חוץ-תאית בתא האחיזה - מיכל סגור ואטום לאור, למשל, צלחת פטרי עם מכסה מכוסה בנייר אלומיניום אום - תחת אטמוספירה של פחמימת חמצן בטמפרטורת החדר (RT). הכניסו פחמימות על ידי בעבוע מאגר מים קטן כדי לשמור על לחות האטמוספירה בתא ההחזקה; זה מונע מהפרוסות להתייבש.
   9. הניחו לפרוסות לנוח בתא ההחזקה למשך 10 - 15 דקות לפני העברתן (אחת אחת) לתא ההקלטה. ניתן לשמור פרוסות עד 4-5 שעות בתא החזקה ב-RT (~21 מעלות צלזיוס).

2. הדמיה של שני פוטונים²⁺ הדמיה

1. }מיקרוסקופ דו-פוטוני
   1. השתמש במיקרוסקופ דו-פוטוני מסוג מיקרוסקופ אובייקטיבי נייד (MOM).
      הערה: ניתן להשתמש בכל מיקרוסקופ דו-פוטוני זקוף העונה על הדרישות המינימליות הבאות: עליו להיות מצויד ב-(a) לייזר פועם הניתן לכוונון ל-~860 ננומטר, (b) מינימום של שני ערוצי פלואורסצנטיות שנרכשו בו זמנית, (c) מסננים לחלבון פלואורסצנטי ציאן משופר (eCFP) ופלואורסצנטי ציטרין, (d) ממריץ אור, ו-(e) תוכנה המאפשרת להקליט רצפי תמונות שחלפו זמן בקצב פריימים מספיק כדי לפתור את האותות המעניינים Ca²⁺.
   2. הפעל את מערכת ההדמיה הדו-פוטונית כפי שצוין על ידי היצרן. עקוב בקפדנות אחר הנחיות בטיחות הלייזר של המתקן. הפעל את הלייזר וכוון אותו ל-~860 ננומטר.
   3. העבירו פרוסה מתא ההחזקה לתא ההקלטה והתחילו מיד לחלחל בתמיסה חוץ-תאית פחמימות. שמור על קצב זרימת זלוף של 2 מ"ל/דקה וטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בתא ההקלטה.
   4. השתמש ביעד טבילה במים של צמצם מספרי (NA) של 20X 0.95. אם זמין, השתמש במצלמת התקן מצמד טעינה (CCD) בשילוב עם דיודה פולטת אור אינפרא אדום (LED) מתחת לתא ההקלטה כדי לאתר את פרוסת הרשתית ( איור 2). אחרת, אתר את הפרוסה באמצעות הדמיה של שני פוטונים (ראה 2.1.5).
   5. עבור להדמיה של שני פוטונים כדי להציג ביטוי חיישן ביולוגי. הפעל את שני ערוצי הזיהוי להדמיה פלואורסצנטית של eCFP וציטרין.
   6. השתמש בתוכנת רכישת התמונות השולטת במיקרוסקופ דו-פוטוני כדי לסרוק ולבחור שורה של מסופי חרוט להקלטה (איור 3A). הגדר את רכישת התמונות לתמונות בגודל 128 x 16 פיקסלים (31.25 הרץ) או לתצורה דומה. הגבל את האזור הסרוק למסופי חרוט כדי למנוע הלבנת פוטופיגמנטים במקטעים חיצוניים.
      הערה: עבור חיישן הסידן TN-XL (τ = ~0.6 שניות עבור כריכת Ca²⁺, τ = ~0.2 שניות עבור Ca²⁺), מומלץ קצב פריימים מינימלי של ~8 הרץ.
   7. גירוי אור והקלטה
      1. השתמש בגירוי אור בשדה מלא תת-שלב כדי לבצע את השלבים הבאים.
         הערה: פתרון פשוט לממריץ אור בשדה מלא הוא להשתמש בשתי נוריות LED מסוננות פס ( למשל, "כחול": 360 פס פס (BP) 12, "ירוק": 578 BP 10) התואמות את רגישויות אורך הגל של מדוכים של עכבר, אך יחד עם זאת אינן חופפות למסננים המשמשים לזיהוי פלואורסצנטי. האור מנורות הלד ממוקד על ידי המעבה דרך החלק התחתון של תא ההקלטה ( איור 2).
      2. הפעל את הלייזר ואפשר לקונוסים להסתגל ללייזר הסורק ולאור הרקע של הגירוי (20 - 30 שניות) לפני הצגת גירויי אור (ראה 2.2.3) או יישום חומרים פרמקולוגיים.
      3. התחל להציג גירויים שרירותיים ( למשל, הבזקי אור, כפי שמוצג ב-איור 3B, C). במקרה של הממריץ המתואר בשלב 2.2.1, צור את הגירויים על ידי אפנון עוצמת שתי נוריות הלד לאורך זמן באמצעות לוח מיקרו-מעבד הנשלט על ידי תוכנה מותאמת אישית.
      4. התחל להקליט את שני ערוצי הקרינה ( למשל., ב-483 ננומטר עבור "כחול"
   8. Förster resonance energy transfer (FRET)-eCFP תורם וב-535 ננומטר עבור מקבל FRET "צהוב") בו-זמנית באמצעות תוכנת רכישת התמונות המתאימה (ראה גם 2.1.6). לדוגמה, במקרה של הבזקי אור (איור 3B, C), רשום לפחות 8 - 10 מצגות גירוי (ניסויים).

תוצאות

איור 1. הכנת פרוסות רשתית אנכיות. (א) רשתית מבודדת ושטוחה מוכנה לחיתוך. (ב) חתיכת רשתית מלבנית (ראה תיבה אדומה ב-A) מותקנת על קרום נייר סינון (אפור כהה) לאחר החיתוך. (ג) מבט מלמעלה על פרוסת הרשתית המותקנת על ה...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
גריז ואקום גבוה	Dow Corning	1018817
http://www.dowcorning.com כיסוי מחליקים	R. Langenbrinck		24 x 60 מ"מ;
http://www.langenbrinck.com זכוכית שקופיות	R. Langenbrinck		76 x 26 מ"מ; http://www.langenbrinck.com
להבים לקוצץ רקמות	MARTOR KG	ARGENTAX מס' 1044	0.25 מ"מ; http://www.martor.de
קוצץ רקמות	בהתאמה
מרושתת	Merck Millipore	AABG01300	סוג מסנן: 0.8 מיקרומטר;
ממריץ שדה מלא מבוסס http://www.emdmillipore.com UV/ירוק LED
לוח מיקרו-מעבד קוד פתוח	Arduino		http://www.arduino.cc
תוכנת הדמיה CfNT	בהתאמה		פותח על ידי Michael Müller, MPI למחקר רפואי, היידלברג, גרמניה
IgorPro	Wavemetrics		http://www.wavemetrics.com
מוקד מערכת VC3-4 מערכת זלוף	ALA מכשיר מדעי		עם סעפת קצה בקוטר 100 מיקרומטר; http://www.alascience.com/
Mai Tai HP DeepSee (Ti:Sapphire laser)	Newport Spectra-Physics		http://www.spectra-physics.com
מיקרוסקופ אובייקטיבי נייד (MOM), תוכנן על ידי W. Denk, MPImF, היידלברג, גרמניה	Sutter Instruments		http://www.sutter.com/MICROSCOPES/index.html
XLUMPlanFL 20x/0.95w אובייקטיבי	אולימפוס		http://www.olympusamerica.com
Leica MZ95	Leica מיקרו-מערכות		http://www.leica-microsystems.com/

ממברנת מסנן ניטרוצלולוזה אישית אישית