הדמיית תאים חיים של נדידת גרעין גליית מולר במהלך התחדשות רשתית דג הזברה

תקציר

מקור: Lahne, M., et.al. תרבית של צמחי רשתית של דג זברה טרנסגני בוגר להדמיית תאים חיים על ידי מיקרוסקופ מולטיפוטון. J. Vis. Exp. (2017)

סרטון זה מדגים הדמיה של תא חי של נדידת גרעין גליה של מולר באקספלנטים של רשתית דג הזברה המשובץ באגרוז בעקבות נזק לקולטני אור המושרה על ידי אור. גורם נמק גידול-אלפא (TNF-α) המשתחרר על ידי קולטני אור פגומים מפעיל תאי גליה של מולר, ומפעיל נדידה גרעינית דרך השכבות הגרעיניות הפנימיות והחיצוניות למיטוזה ויצירת אבות עצביים. התמונות שצולמו חושפות את הדינמיקה של הגירה גרעינית והתמיינות אבות במהלך התחדשות הרשתית.

פרוטוקול

כל ההליכים הכוללים דגימות של בעלי חיים נבדקו ואושרו על ידי ועדת הביקורת האתית המתאימה לבעלי חיים.

1. מיקרוסקופיה מרובת פוטונים

הערה: הניסויים שבוצעו בכתב יד זה עברו אופטימיזציה למיקרוסקופ רב-פוטוני המצויד בלייזר אינפרא אדום (ראה טבלת חומרים), אובייקט טבילה במים למרחקים ארוכים 40X Apo (NA 1.15), סורק גלוונומטר ותא סביבתי המכיל תוספת לארבע צלחות פטרי 35 מ"מ. התמונות נרכשו באמצעות גלאי לא נסרק (R-NDD).

1. לפני ההדמיה, יש לאזן את התא הסביבתי כדי להשיג 5% CO₂/אוויר אטמוספירה. ודא שכלי פטרי ריקים מוכנסים למחזיק כדי למנוע דליפת גז לחדר.
2. הפעל את מערכת המיקרוסקופיה.
3. לאחר שיווי המשקל של התא הסביבתי, הוסף נוזל מקדם שבירה על יעד הטבילה במים למרחקים ארוכים 40X Apo (NA 1.15).
   הערה: נוזל מקדם השבירה בעל תכונות אופטיות הדומות למים משמש למניעת אידוי מים במהלך הדמיה ארוכת טווח.
4. מניחים פלואורוסקופים עם צמחי רשתית לתוך החדר. באמצעות אור שדה בהיר, מקם את הדגימה לנתיב האור והביא את אזור האמצע של הרשתית הגבית למישור המיקוד.
5. השתמש באור אפיפלואורסצנטי GFP כדי להתמקד בגרעיני Müller glia חיוביים ל-gfap:nGFP (איור 1A, C).
   הערה: אם האקספלנטים אינם מותקנים שטוחים או אגרוז שהצטבר מתחת לאקספלנט, יהיה קשה להתמקד בגרעינים החיוביים gfap:nGFP או שהם יזוהרו במעומעם.
   1. בדוק אם מעבר לאזור אחר בתוך אותו צמח רשתית יתגבר על בעיית המיקוד. אחרת יש לעבור לכריתת רשתית אחרת.
6. בתוכנת רכישת התמונות, פתח את החלונות 'A1 MP GUI', 'TiPad', 'A1 Compact GUI' ו-'ND acquisition'. להדמיה מרובת פוטונים, ודא שהאפשרות 'IR NDD' נבחרה ב-'A1 Compact GUI'.
7. בשדה 'הגדרה', בחר IR-DM עבור המראה הדיכרואית הראשונה ובחר את מסנן מעבר הפס 525/50 כדי לרכוש פלואורסצנטיות GFP.
8. הפעל את לייזר ה-IR בחלון שכותרתו 'A1MP GUI'. ייקח כמה דקות עד שהלייזר יהיה מוכן. הגדר את אורך הגל ל-910 ננומטר כדי לעורר פלואורסצנטיות GFP וליישר את הלייזר על ידי לחיצה על כפתור 'יישור אוטומטי' בחלון 'A1 MP GUI'.
9. ודא שאורות החדר והציוד כבויים או מכוסים לפני פתיחת התריס ב-'A1 MP GUI' כדי למנוע חשיפת יתר של צינור מכפיל הפוטו. כדי להפחית את רמות הרעש, שכן את המיקרוסקופ בסביבה חשוכה.
10. קבל תמונות של שדה ראייה של 300 x 300 פיקסלים, בזום של שניים, וזמן שהייה של פיקסלים של 4.8 מיקרון/פיקסל. הגדר בערך את עוצמת הלייזר על ידי שינוי 'אזור הרכישה' ב-'A1MP GUI' ואת הרווח בחלון 'A1 Compact GUI'.
11. הגדרת z-stack
    1. התמקד בשכבת תאי הגנגליון (GCL) כדי להגדיר את מישור המוקד העליון של מחסנית ה-z בחלון המשנה 'z' בתוך חלון 'רכישת ND'. חלק מהתאים החיוביים ל-gfap:nGFP ממוקמים בדרך כלל בשכבת תאי הגנגליון, מה שמסייע לזהות את הגבול הבסיסי של הרשתית (איור 1A, D).
    2. הזיזו את מישור המוקד דרך רמת השכבה הגרעינית החיצונית (ONL) (איור 1A, B), המאופיינת בנוכחות של תאים חיוביים gfap:nGFP המסומנים במעומעם, שהם עגולים ומוגדלים ביחס למקביליהם בשכבת הגרעין הפנימית (INL) (איור 1A, C).
    3. הגדר מישור זה כתחתית ערימת ה-z. ודא שכל ה-ONL יצולם (איור 1A, B).
    4. כאשר חווים תזוזות מישור מוקד הדורשות התאמה מחדש במהלך תקופת ההדמיה, לחץ פעמיים על המיקום האמצעי בחלון המשנה 'z' כדי להקצות אותו כמיקום 'בית'. שנו ל'מצב סימטרי מוגדר' ולחצו על 'יחסי'.
    5. הגדר את גודל צעד ה-z בין 0.7 ל-1 מיקרומטר.
12. תיקון עוצמת Z:
    1. החל תיקוני עוצמת z כדי לפצות על אובדן עוצמת הפיקסלים עקב פיזור אור בעת הדמיה בשכבות עמוקות של הרקמה.
    2. כדי להגדיר את התיקון, פתח את החלון 'תיקון עוצמת z'. כדי להגדיר את טווח ה-z-stack, בוחרים באפשרות 'מ-ND'.
    3. לחץ על מישור המוקד התחתון בחלון 'תיקון עוצמת z' (במקרה זה, מתאים לשכבת תאי הגנגליון) והגדר את עוצמת הלייזר ('אזור רכישה' ב-'A1MP GUI') ואת הרווח (A1 Compact GUI).
    4. לחץ על החץ לצד 'ערכי z' בחלון 'תיקון עוצמת z' כדי לאשר את ההגדרות המוצגות לאחר מכן תחת 'הגדרות התקן' בחלון 'תיקון עוצמת z' עבור מישור המוקד שנבחר.
    5. חזור על התהליך עבור המישור האמצעי והעליון, והגדל את עוצמת הלייזר והרווח. ניתן להוסיף מישורי מוקד נוספים במידת הצורך. ראה טבלה 1 להגדרות לייזר ורווח ספציפיות לניסויים באיורים 1 - 3.
    6. הגדר את 'אזור הרכישה' בחלון 'A1 MP GUI'. הימנע מבחירת אזור רכישה גדול מ-15 ורווח גבוה מ-126 בתחילת ההדמיה כדי לעקוף הלבנת אור ורמות רעש מוגברות.
       הערה: מכיוון שלייזרים וצינורות מכפיל פוטו שונים בין מערכות מיקרוסקופיה, בדוק את הגדרות הלייזר והרווח כדי להשיג תנאי הדמיה אופטימליים עבור הגדרת המיקרוסקופ תוך הימנעות מהלבנת פוטו.
    7. בחר 'תיקון עוצמה יחסית' בחלון 'תיקון עוצמת z'.
13. בחלון המשנה 'סדרות זמן' בחלון 'רכישת ND', הגדר את משך הזמן ל-8 שעות ואת המרווח ל-'ללא עיכוב'. לאחר מכן, הקפד ללחוץ על 'הפעל תיקון z' בחלון המשנה 'z-stack' בלחצן החלון 'רכישת ND' כדי לרכוש את סדרת הזמן התלת-ממדית.
14. שמור על צמחי רשתית בטמפרטורה של 27 - 29 מעלות צלזיוס לאורך כל זמן רכישת התמונה.
15. לאורך כל תקופת רכישת התמונה, במידת הצורך, כוונן מחדש את רמת ההספק והרווח על מנת לשמור על איכות התמונה לניתוח לאחר ההדמיה. להתאמות בצע את שלבים 1.11.2 - 1.11.4.
16. אם מישור המוקד זז, השהה או עצור את הריצה ובצע שוב את שלב 1.11..
    הערה: אם נבחר 'תיקון z יחסי' בשלב 1.12.7 ובוצע שלב 1.11.4, אין צורך להתאים מחדש את רמות הכוח והרווח, אלא אם כן התרחשה הלבנת אור נרחבת.

טבלה 1: רמות לייזר ורווח המשמשות לתיקוני עוצמת z במישורים השונים עבור ניסויים המוצגים באיורים 1 - 3.

	Tg[gfap:EGFP]nt11		Tg[rho:Eco.NfsB-EGFP]nt19
	כוח לייזר	רווח	כוח לייזר	רווח
עליון (קולטן אור מוט)	13	126	3.5	118
אמצעי (מולר גליה)	10	126	2.8	118
תחתון (שכבת תאי גנגליון)	8	126	2.1	118

תוצאות

איור 1: שחזור תלת-ממדי של ערימות Z מרובות פוטונים ברשתית. A) שחזור תלת-ממדי של סדרת תמונות z-stack מרובת פוטונים של gfap:nGFP- בתרביות רשתית שלמות מדגי זברה לאחר 48 שעות של נזק אור. B - D) תמונות xy מרובות פוטונים בודדו...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
מדויקים בעולם	פלואורצ'ה	FD35-100
סטריאומיקרוסקופ	Nikon	SMZ-1B	סוג דומה של סטריאומיקרוסקופ דיסקציה יעבוד
מנורות פלורסנט סילבניה OSFP5835HOECO	Bulbtronics	31850
נוזל מקדם שבירה	Cargille Lab	1803Y
מיקרוסקופ מולטיפוטון Nikon A1 מצויד בלייזר אינפרא אדום MaiTai	מערכת מקבילה של	Nikon
40x Apo מטרת טבילה במים למרחקים ארוכים (NA 1.15) תא סביבתי מצויד בתוספת ל-35 מ"מ פטריצ'ישים	ל-Okolab		יעבוד
תוכנת ניתוח NIS	ניקון

מכשירים תעבוד מערכת שווה ערך