הדמיית נזק מוחי שנגרם על ידי היפוקסיה-איסכמיה מוחית במודל עכבר

תקציר

מקור: Ouyang, Y., et al. הדמיית PET/MRI סימולטנית במהלך היפוקסיה מוחית של עכבר. J. Vis. Exp. (2015)

סרטון זה מדגים טכניקה להערכת פגיעה בהיפוקסיה מוחית באמצעות טומוגרפיה סימולטנית של פליטת פוזיטרונים (PET) והדמיית תהודה מגנטית (MRI). עכבר מורדם עובר קשירת עורק הצוואר המשותף (CCA), מה שמפחית את זרימת הדם לחצי מוח אחד וגורם לו לפגיעה הנגרמת על ידי היפוקסיה. הדמיית PET ו-MRI מעריכה את חילוף החומרים של הגלוקוז ושינויים מבניים במהלך היפוקסיה. MRI מזהה דיפוזיה מוגבלת של מים, בעוד ש-PET חושף ספיגת גלוקוז מופחתת, מה שמעיד על מתח תאי הנגרם על ידי היפוקסיה ופגיעה מטבולית.

פרוטוקול

כל ההליכים הכוללים מודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ומועצת הביקורת הווטרינרית של JoVE.

1. קשירת עורק הצוואר המשותף (CCA) חד צדדית

1. הכן שדה סטרילי עם כלים וחומרים כירורגיים מעוקרים הממוקמים בנוחות. ודא שכרית החימום מחוממת ל-37 מעלות צלזיוס כאשר בדיקת הטמפרטורה מונחת היטב על הכרית. הקפד להשתמש בווילון סטרילי כדי לכסות את אתר הניתוח.
2. הרדמה של בעל חיים (איזופלורן, 1-3% באוויר ב-0.5-1 ליטר לדקה), והנח את בעל החיים במצב שכיבה כשהזנב פונה הצידה. בדוק את ההרדמה על ידי צביטה של הבוהן - זה לא אמור לעורר תגובה אם החיה מורדמת כראוי. יש למרוח משחה עיניים על העיניים.
3. יש למרוח קרם אפילציה על הצוואר התחתון עד לאזור החזה העליון באמצעות 1-2 מקלוני צמר גפן. המתן 1-3 דקות, ולאחר מכן הסר שיער וקרם באמצעות גזה רטובה או ספוגיות אלכוהול. מטוש אזור חתך עם בטדין בצורה מעגלית מבפנים לחוץ, ולאחר מכן החלף לכפפות כירורגיות סטריליות.
4. בעזרת מספריים כירורגיים, בצע חתך של כ -1 ס"מ לאורך קו האמצע של הצוואר התחתון. הפרד בזהירות את העור החיצוני מהפאשיה שמסביב באמצעות מספריים כירורגיים.
5. בעזרת שני מלקחיים לתפירת מיקרו קשתית של McPherson, הפרד את עורק הצוואר המשותף הימני מהפאשיה, הקפד להימנע מפגיעה בוורידים או הפרעה לעצב התועה.
6. בעזרת המלקחיים מימין, הוצא את ה-CCA הימני במצב יציב. יש למרוח מספר טיפות מי מלח למניעת התייבשות. העבירו אורך מתאים (2-3 ס"מ) של תפר משי 6-0 מתחת ל-CCA הימני וקשרו באמצעות קשר מרובע כפול. לחלופין, יש לקשור שוב באמצעות תפר משי באורך שני של 6-0.
7. מקם מחדש את ה-CCA הימני ונקה עודפי נוזל מהפתיחה באמצעות ספוגית סטרילית עם קצה ספוג. סגור את החתך עם תפר משי 6-0. יש למרוח לידוקאין באופן מקומי עד 7 מ"ג/ק"ג.
8. אפשרו לבעל החיים להתאושש מההרדמה עד לאמבולטורי (כ-30 דקות) ובצעו ניטור לאחר הניתוח עד שהחיה מוכנה להדמיה.

2. הכנה להדמיה: בדיקות מערכת וחומרה

1. הגדר חומרה ותוכנה למערכות MRI ו-PET ובדוק את הפונקציונליות שלהן כדלקמן. ודא שכל החיבורים הפיזיים מאובטחים והגדרות התוכנה נבחרו כראוי.
   1. ודא שמערכת ה-PET נמצאת בטמפרטורת ההפעלה שנקבעה של 5 מעלות צלזיוס באמצעות מערכת קירור האוויר.
   2. התקן מערכת PET בתוך קדח ה-MRI, יישור מרכזי שדה הראייה של PET ו-MRI (FOV) באמצעות היסטים ציריים ידועים. התקן את סליל ה-MRI בתוך הקדח של מערכת ה-PET ומרכז את הסליל עם מערכת ה-PET ומרכזי המגנט של ה-MRI.
   3. הפעל אלקטרוניקה PET עבור מתח והטיהtage (הערה: השלבים ישתנו בהתאם למכשיר). בצע סריקה מהירה (5 דקות) באמצעות גליל 68Ge ובדוק את הסינוגרמה המתקבלת כדי לוודא שכל הגלאים פועלים.
   4. לחלופין, רכוש נתונים שישמשו למטריצת טרנספורמציה של PET/MRI למטרות רישום משותף: מלא פנטום תלת מימדי (למשל, שלושה כדורים מלאים) ב-200 μCi של תמיסה מימית 18F ורכוש למשך 15 דקות עם PET. רכוש נתוני MRI אנטומיים: בחלון בקרת הסריקה, בחר את רצף מרובה הפרוסות (MSME) (ראה טבלה 1). חזור על הפעולה עבור כל שלושת הכיוונים העיקריים: צירי, סגיטלי ועטרתי.
2. בדוק את הגדרות משאבת העירוי ותפעולה. הגדר את המשאבה ל-4.44 מיקרוליטר לדקה, אשר ב-45 דקות של עירוי קבוע מספק נפח כולל של 200 מיקרוליטר, הגבול המומלץ האופייני להזרקה תוך ורידית (IV) בבעל חיים של 20 גרם.
3. בדוק את פעולת החימום ואשר שתפוקת הטמפרטורה מספיקה כדי לשמור על חום החיה (37 מעלות צלזיוס). בדוק שניטור הטמפרטורה והנשימה פועל כהכנה להנחת בעלי החיים על מיטת החיה.
4. בדוק את פעולת מדי הזרימה O2 ו-N2 (עבור 0.5 ליטר לדקה: O2 ב-57.2 מ"ג/דקה ו-N2 ב-0.575 גרם/דקה) על ידי הפעלת שניהם כשמקור האוויר הדחוס כבוי ומקורות O2 ו-N2 מופעלים. כדי למנוע את הסיכון לפגיעה במדי הזרימה, אל תפעיל אותם ללא לחץ כניסה מספיק.
5. ודא שמכשיר האידוי איזופלורן מלא מספיק. לפני ההדמיה, התחל את זרימת ההרדמה של איזופלורן ב-1-2% ו-0.5 עד 1 ליטר לדקה.
6. הכן מיטת בעלי חיים על ידי הקפדה על כך שמערכות ההרדמה, כרית הנשימה והחימום ממוקמות בצורה מאובטחת ומתפקדת. לדיוק נוסף ברישום משותף של PET/MRI, ניתן לחבר סמנים פידוציאליים (למשל, צינורות נימיים מלאים ברדיו-טריסר בריכוז דומה לזה שהוזרק להדמיה) למיטת החיה בשדה הראייה.

3. זרימת עבודה של הדמיה

לאחר השלמת כל בדיקות הציוד הדרושות, המשך להדמיה באופן הבא:

1. הרדמה של בעל החיים עם איזופלורן והכנסת קטטר וריד זנב (מחט 28 גרם, צינור PE-10 פחות מ-5 ס"מ) מלא במי מלח הפריניים (0.5 מ"ל הפרין, 1,000 USP/מ"ל, ב-10 מ"ל מי מלח). חימום החיה ו/או הזנב עשוי לשפר את דיוק החדרת הצנתר. לחלופין, הנח טיפה של דבק ציאנואקרילט על מקום ההחדרה כדי לאבטח את קו העירוי.
2. העבירו את החיה למיטת בעלי החיים המוכנה. ודא שראש החיה מאובטח, כאשר החותכות העליונות מאובטחות על ידי מוט השיניים ומוטות האוזניים במקומם אם נעשה בהם שימוש.
3. מרחו משחה עיניים על העיניים למניעת יובש. הכנס מדחום בדיקה פי הטבעת. ודא שקריאות הטמפרטורה והנשימה תקינות.
4. משוך את מינון הרדיו-טרסר (בסביבות 600 μCi ב-200 מיקרוליטר) להזרקה לצינורות PE-10 הפריניים באורך מתאים - כ-3 מ' לצינורות PE-10 ונפח של 200 מיקרוליטר. חבר קצה אחד של צינור זה למזרק משאבת העירוי, ואת השני לקו הצנתר של וריד הזנב, מקפידים לא ליצור פנצ'רים בצינורות.
5. החלק את מיטת החיות קדימה לתוך קדח המגנט, הקפד לא להפריע למיקום סליל ה-MRI וכל קווים או כבלים, במיוחד צינור ההרדמה. ודא שמרכז המוח מיושר עם מרכזי סליל ה-MRI, מערכת ה-PET ומגנט ה-MRI.
6. בצע כוונון והתאמה של סליל ה-MRI על ידי סיבוב כפתורי הכוונון על הסליל, מזעור אי-התאמות עכבה (בדוק את מפרט הסליל) ותדר (300 מגה-הרץ עבור 1H ב-7 טסלה) על ידי התבוננות בתצוגה של הקדם-מגבר בעל הספק גבוה.
7. (MRI) לאחר כוונון והתאמה, רכוש תמונת סקאוט: בחר רצף תלת-טייס של הדמיה מהירה עם הדים ממוקדים מחדש (RARE) והפעל את הרצף מחלון בקרת הסריקה. בדוק את מיקום החיה, חזור על שלבים 3.5 ו-3.6 לפי הצורך. איפוס shims לערך אפס.
8. (MRI) רכשו סריקה ספקטרוסקופית מקומית (PRESS) באמצעי אחסון בתוך המוח: הריצו רצף PRESS (ראו טבלה 1) בנפח מלבני במידות 3.9 מ"מ × 6 מ"מ ×-9 מ"מ. בדקו את רוחב קו המים באמצעות פקודת המאקרו CalcLineWidth. אם הרוחב המלא בערך חצי מקסימלי (FWHM) מקובל (למשל, 0.2 עמודים לדקה), המשך לשלב 3.10. אם לא, המשך לשלב 3.9.
9. (MRI) רכישת מפת שדה: הפעל רצף מפת שדה (ראה טבלה 1). השתמש בנתונים המתקבלים עבור shim הקרנה מרובת זוויות (MAPSHIM) על ידי הפעלת פקודת המאקרו MAPSHIM ובחירת התאמות מקומיות ליניאריות וסדר שני (z2). חזור על שלב 3.8.
10. (MRI) מקם את תוכנית הפרוסה עבור סריקת הדמיה משוקללת דיפוזיה (DWI) (ראה טבלה 1): באמצעות עורך הגיאומטריה, ודא שה-FOV של הרכישה ממוקם כדי לרכוש את נפח העניין הרצוי בתוך המוח. אם תוכנית הפרוסה המתקבלת מיושרת כרצונך, העתק תוכנית פרוסה זו בחלון בקרת הסריקה עבור כל סריקות DWI הבאות. התחל ברכישה.
11. (PET) כאשר רכישת ה-PET מוכנה ומוכנה להתחיל, הפעל את משאבת העירוי. לאחר העיכוב שנקבע מראש בו הוזרק מי מלח מהצנתר, התחל ברכישת ה-PET (ראה טבלה 1) על מנת ללכוד את כניסת הרדיו-טרסר. עקוב אחר קצב הספירה וחפש עלייה הדרגתית בספירות המעידה על הזרקה מוצלחת.
12. לאחר 10-15 דקות, התחל את האתגר ההיפוקסי במקביל לשלב 3.12. כדי ליזום אתגר היפוקסי, כבה את זרימת האוויר הרפואי והפעל מיד את מדי הזרימה O2 ו-N2 עם ההגדרות שנקבעו מראש כדי לספק 8% חמצן ו-92% חנקן, ולהפחית את האיזופלורן ל-0.8%. אין להפעיל מדי זרימה ללא לחץ כניסה.
13. (MRI) במקביל לשלב 3.12, התחל ברכישת DWI שהוכנה בשלב 3.10 (סרוק "H1").
14. (MRI) התחל ברכישת DWI (סרוק "H2"), שהוכן בשלב 3.10, מיד לאחר השלמת סריקת H1. סיים את האתגר ההיפוקסי על ידי כיבוי מדי זרימה, שחזור זרימת האוויר הרפואי והחזרת ריכוז האיזופלורן לערך מתאים המבוסס על ניטור פיזיולוגי.
15. (MRI) רכוש סריקת DWI לאחר היפוקסיה שהוכנה בשלב 3.10. כבה את משאבת העירוי לאחר השלמת סריקה זו.
16. (MRI) רכוש תמונות אנטומיות במישור הצירי והסגיטלי. בחלון בקרת סריקה - בחר את רצף MSME (ראה טבלה 1). באמצעות עורך הגיאומטריה, ודא שה-FOV של הרכישה מכסה את המוח.
17. יש להוציא את בעל החיים, לחזור לכלוב כשהוא אמבולטורי ולעקוב אחר סימני תחלואה, לבצע המתת חסד במידת הצורך עם מתן CO2 ואחריו פריקת צוואר הרחם כשיטה משנית.

טבלה 1. פרמטרים של רצף דופק MRI לסריקות המתוארות בפרוטוקול, ופרמטרים של רכישת PET, היסטוגרמה ושחזור.

Imaging Acquistion Parameters and Hardware
Acquisition Diffusion MRI (EPI-DWI)
זמן רכישה	15 דקות
גודל מטריצה	256 x 64
פרוסות	10
FOV	30 x 14 x 8 מ"מ
גודל Voxel	0.117 x 0.219 x 0.8 מ"מ
רוחב פס ספקטרלי אפקטיבי	150 קילו-הרץ
TE	41 msec
TR	3,000 msec
ממוצע	6
k-space	16
ערכי b	0, 400, 800 שניות/מ"מ
MRI אנטומי (MSME)
זמן רכישה	5 דקות
גודל מטריצה	256 x 256
פרוסות	16
FOV	30 x 22 x 12.8 מ"מ
גודל ווקסל	0.117 x 0.086 x 0.8 מ"מ
TE	14 msec
TR	1,000 msec
ממוצע	1
חזרות	1
סריקה ספקטרוסקופית ברזולוציה נקודתית (PRESS)
זמן רכישה	15 שניות
גודל Voxel	3.9 x 6 x 9 מ"מ
TE	20 msec
TR	2,500 msec
ממוצעים	6
FieldMap
זמן רכישה	1 דקה 21 שניות
TE ראשון	1.49 מ"ש
TE שני	5.49 מ"ש
TR	20 מ"
ש ממוצעים	1
רכישת PET, היסטוגרמה, ופרמטרים של שחזור
Tracer	[18F]FDG
קצב עירוי	4.44 μL/min
זמן רכישה	60 דקות
גודל תמונה לפרוסה	128 x 128
פרוסות	99
גודל Voxel	0.4 x 0.4 x 0.6 מ"מ
מסגור דינמי	12 x 300 שניות
סוג שחזור	OS-MLEM (6 תת-קבוצות, 6 איטרציות)

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
מספריים כירורגיים
	Roboz	RS-5852
מלקחיים	Roboz	RS-5237
מלקחיים נגד יתושים הרטמן	Miltex	7-26
2x מלקחיים לתפירת מקפרסון, 8.5 ס"מ	מכשירים כירורגיים ומדעיים מדויקים	4473	כדאי להקטין את רוחב הפתח עם רצועה על המלקחיים המשמשים להחזקת עורק הצוואר
6-0 תפר משי קלוע מצופה סיליקון עם 3/8 מחט C-1	Covidien Sofsilk	S-1172
מערכת שמיכות הומותרמית	מכשיר הרווארד	507220F
סופר מד
עבור O₂Alicat	Scientific	MC-500SCCM-D
מד עבור N₂Alicat	Scientific	MC-5SLPM-D
O₂ meter	MSA	Altair Pro
הדמיה
7.05 מערכת MRI טסלה	Bruker	BioSpec	קוטר קדח פנימי 20 ס"מ עם סט שיפוע. תוכנת Paravision 5.1.
נפח Tx/Rx 1H סליל, 35 מ"מ ID	Bruker	T8100
מערכת PET	(פנימית)		4x24 גלאי LSO-PSAPD,
מערך 10x10 LSO לכל גלאי,
גובה קריסטל 1.2 מ"מ ועומק 14 מ"מ. 14 x 14 מ"מ PSAPD. FOV: 60x35 מ"מ. חלון אנרגיה של 350-650 קילוואט. חלון תזמון של 16 ns.
קנולציה של כלי דם מלקחיים Dumont	Roboz	RS-4991
PE-10 צינורות פוליאתילן	BD Intramedic	427401
משאבת עירוי	Braintree Scientific	BS-300
ציוד ניטור ושער בעלי חיים	Animal Instruments Inc.	דגם 1025	נעשה שימוש רק בניטור נשימה
מיטת בעלי חיים עם ויסות טמפרטורה	(בבית)

זרימת היפוקסיה דבק (גנרי) Small