הדמיית זמן-lapse של תאי קליפת המוח הראשונית של העכבר שעברו טרנספטציה

תקציר

מקור: Landeira, B. S.,et al., הדמיה חיה של תאי קליפת המוח הראשונית באמצעות מערכת תרבית דו-ממדית. J. Vis. Exp. (2017)

הסרטון מדגים את השימוש בהדמיית זמן-lapse כדי לעקוב אחר אבות קליפת המוח המסומנים פלואורסצנטית, לנטר את החלוקה וההתמיינות שלהם, ולחקור את התפתחות השושלת בתאי קליפת המוח הראשונית

פרוטוקול

1. מיקרוסקופ וידאו בהילוך מהיר

הערה: שלב זה דורש מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך עם תא דגירה (ראה טבלת חומרים).

1. לאחר זיהום הרטרו-וירוס, הנח את לוחית תרבית הרקמה באינקובטור המחובר לבקרי טמפרטורה ו-CO₂.
   הערה: חימום מוקדם של התא למשך 3 שעות לפני תחילת ההדמיה יכול לעזור למזער את הסחיפה וחוסר המיקוד במהלך הרכישה.
   הערה: התא צריך לשמור על התאים בתנאים קבועים של 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO₂.
2. בחר מיקום בציר XY שישמש כנקודת אפס (XY = 0). זה יאפשר הפניה למצוא את המיקומים שוב בעתיד.
   הערה: רצוי לצייר שלט על הצלחת שיכול לשמש כהתייחסות לקביעת נקודת האפס.
3. בחר את המיקומים שיש לצלם בהגדלה של פי 10.
   הערה: בחר 10-15 מיקומים לכל באר כדי להגדיל את הסבירות להתבוננות בתאים שעברו טרנספטציה רטרו-ויראלית.
   הערה: ניתן להשתמש ביעדי הגדלה גבוהים למרחקים ארוכים (20X או 40X) כדי לקבל תמונות ברזולוציה גבוהה יותר. בהתאם למרחק העבודה של היעדים, ייתכן שיידרשו לוחות תחתית זכוכית.
4. רכוש תמונות ניגודיות פאזה כל 5 דקות ותמונות פלואורסצנטיות כל 3 שעות כדי להפחית את הפוטוטוקסיות. בדוק והתאם את המיקוד ב-3 השעות הראשונות של הניסוי, מכיוון שהוא עשוי להשתנות בזמן שהטמפרטורה מתאזנת. בדוק והתאם את המיקוד מדי יום.
   הערה: אנו רואים שהמיקוד הופך ליציב לאחר 24 השעות הראשונות. עם זאת, רצוי לעקוב אחר המיקוד. לחלופין, השתמש במערכת פוקוס אוטומטי מבוססת תוכנה.
5. לאחר 7 ימים, הפסק את הרכישה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
ImageJ	NIH
}tTt	}ETH ציריך	}
}} מיקרוסקופ משקיף תא	}
}תוכנת כלי המעקב (tTt)		https://www.bsse.ethz.ch/csd/software/ttt-and-qtfy.html