$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
כל ההליכים הכוללים דגימות של בעלי חיים נבדקו ואושרו על ידי ועדת הביקורת האתית המתאימה לבעלי חיים.
1. צביעה פלואורסצנטית של אינטרנוירונים חיים
1. מעבירים פרוסות מוח קטן עם פיפטת פסטר קטומה מזכוכית רחבה לצלחת של 6 בארות (מקסימום 3 פרוסות לבאר). שאפו את המדיום של תמיסת המלח המאוזנת (HBSS) של הנקס.
2. דגירה של פרוסות (3 מקסימום) ב-5 מ"ל של תמיסת טעינה של הצבע הפלואורסצנטי (10 מיקרומטר).
3. כדי להגן מפני אור, מכסים את המיקרופלייט בנייר אלומיניום. הניחו אותו על שולחן הזזת ג'ירו ב-35 סל"ד למשך 10 דקות ב-RT כדי להקל על תיוג התאים.
4. מעבירים פרוסות על הממברנה של תוספת Transwell (גודל נקבוביות 3.0 מיקרומטר; איור 1D) עם פיפטת פסטר קטומה מזכוכית רחבת קדח. שאפו את אמצעי הטעינה בעזרת פיפטה.
5. הסר את התוספת ומלא את הבאר ב-1.9 מ"ל של מדיום הנשר השונה של דולבקו (DMEM). החזר את התוספת והוסף 100 מיקרוליטר של DMEM על גבי הפרוסה כדי לכסות את הרקמה.
6. הנח את הצלחת המכילה את תוספות התרבות בתא החממה (37 מעלות צלזיוס, 5% CO2) למשך שעתיים וזה מספיק כדי לצפות בתאי גרגיר (GCs) בשכבה המולקולרית (ML). הניחו רקמות שטוחות כדי לאפשר היצמדות לקרום ההכנסה (איור 1E). ודא שהפרוסות אינן מתייבשות.
2. אקס ויוו }הדמיה באמצעות מאקרוסקופיה קונפוקלית
1. העבירו את הצלחת ללא מכסה הפלסטיק לחממה המחוברת למעמד של מקרוסקופ קונפוקלי. הנח מכסה זכוכית על תוספת הצלחת של המקרוסקופ. שמור על טמפרטורת החדר על 37.0 מעלות צלזיוס ± 0.5 מעלות צלזיוס וספק לפרוסות זרימת גז קבועה (95% O2, 5% CO2) דרך תוספת הצלחת כדי לשמור על ה-pH קבוע. המתן שעתיים נוספות לפני ניסוי זמן-lapse.
2. כדי לדמיין נדידת GC בפרוסות הרקמה, האירו את התכשיר באור באורך גל של 488 ננומטר באמצעות דיודת לייזר באמצעות מקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי המצויד במטרה יבשה X2 (מרחק עבודה: 39 מ"מ, קוטר: 58 מ"מ, NA = 0.234), וזיהוי פליטת פלואורסצנטיות מ-500 עד 530 ננומטר.
1. כדי לפתור בעדינות את התנועה של GCs, רכוש תמונות עם גורם זום אופטי נוסף של 1.5 עד 2.0. אסוף תמונות של GCs במישור מוקד יחיד או עד 10 מישורי מוקד שונים לאורך ציר z כל 30 דקות למשך עד 12 שעות.
3. במידת הצורך, הסר את מכסה הזכוכית והוסף כמויות קטנות (1-10 מיקרוליטר) של מפעילים ביולוגיים או מעכבים ב-DMEM עם פיפטה של 10 מיקרוליטר כדי לחקור את השפעתם על נדידת GC.
3. מעקב אחר תאים
1. עבור כל פעם של הסרט, בצע הקרנת z-stack דרך מצב סוג ecart ב-ImageJ. אפולת הניגודיות ורמות הבהירות של התמונות העוקבות כדי להקל על הזיהוי והמעקב אחר GCs מסומנים. מפה באופן ידני כל מיקום בתמונת הייחוס (ב-t = 0).
1. השתמש בתוסף "מעקב ידני" בתפריט ניתוח חלקיקים וקבע על ידי לחיצה על נקודת הכבידה של כל גוף תא במהלך זמן-lapse. ייצא את נתוני המעקב הגולמיים בגיליון אלקטרוני.
2. ארגן מחדש את נתוני המעקב הגולמיים המיוצאים מ-ImageJ עם תוכנית ביתית חכמה המזהה כל תא ומיקומים נלווים. באמצעות התוכנית, חשב את מרחק הנסיעה הכולל ואת מהירות ההגירה הממוצעת עבור כל תא. לסווג ולהשוות מאפיינים של נדידת תאים בתנאי בקרה וטיפול תחת מסננים מתאימים באמצעות אותה תוכנית.
