הדמיית זמן-lapse של חלוקת תאי גזע עצביים של עכבר באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית

תקציר

מקור: Daynac, M., et. al. מיון תאים של תאי גזע עצביים ותאי אב מהאזור התת-חדרי של העכבר הבוגר והדמיה חיה של דינמיקת מחזור התא שלהם. J. Vis. Exp. (2015)

סרטון זה מדגים הדמיה בהילוך מהיר של תאי גזע עצביים (NSCs) ממוח של עכבר טרנסגני באמצעות מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי. תאי גזע עצביים זוהרים באדום במהלך שלב G1 ואינם פלואורסצנטיים בשלבים אחרים של מחזור התא. תרבית NSC מודבקת מונחת בתא ההדמיה, נקבעים פרמטרי הדמיה, והתמונות נלכדות במרווחי זמן קבועים למשך הזמן הרצוי.

פרוטוקול

1. הגדרה בסיסית לפני תרבית ומיקרוסקופיית וידאו

1. השתמש בלוחות תרבית עם תחתית זכוכית או צלחות μ למיקרוסקופ וידאו קונפוקלי. עבור תאים בגודל 1 - 5 x 10³ תאים/באר, השתמש בלוחות של 96 בארות, ועבור יותר מ-5 x 10³ תאים/באר, השתמש בלוחות של 24 בארות.
2. לפחות יום אחד לפני תחילת הניסוי, הכינו צלחות מצופות פולי-D-ליזין סטריליות (PDL) לתרביות חד-שכבתיות דבקות. הוסף מספיק PDL (10 מיקרוגרם/מ"ל במים מזוקקים או dH₂O) כדי לצפות את תחתית כל באר ולדגור למשך הלילה (O/N) ב-37 מעלות צלזיוס. הסר את תמיסת ה-PDL ושטוף שלוש פעמים עם dH₂O לפני שתאפשר לצלחת להתייבש במכסה המנוע במשך שעתיים לפחות תחת זרימה למינרית. אם לא נעשה שימוש מיידי, אחסן את הצלחת המצופה בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.
3. הכן מדיום תרבית על ידי ערבוב תאי גזע עצביים (NSC) מדיום בסיסי ותוסף התפשטות NSC ביחס של 9:1 (ראה טבלת חומרים) יחד עם 2 מיקרוגרם/מ"ל הפרין, 20 ננוגרם/מ"ל גורם גדילה אפידרמלי רקומביננטי אנושי מטוהר (EGF), ו-10 ננוגרם/מ"ל גורם גדילה פיברובלסטים רקומביננטי אנושי 2 (FGF-2). יש לחמם את הטמפרטורה הבינונית ל-37 מעלות צלזיוס באמבט מים לפני השימוש.
4. לדיסוציאציה של האזור התת-חדרי (SVZ), הכינו תמיסת פפאין: 1 מ"ג/מ"ל פפאין (15 UI/ml) בתמיסת מלח איזון של ארל'ס (EBSS) המכילה 0.2 מ"ג/מ"ל L-ציסטאין, 0.2 מ"ג/מ"ל חומצה אתילנדיאמינטטראצטית (EDTA) ו-0.01 מ"ג/מ"ל DNase I בתמיסת מלח עם פוספט (PBS). עקר את התמיסה על ידי העברתה דרך מסנן של 0.2 מיקרומטר. אזנו את התמיסה ב-37 מעלות צלזיוס לפני השימוש.
5. כדי לעצור את התגובה האנזימטית, הכינו תמיסת מעכב פרוטאז (Ovomucoid): מדיום הנשר המותאם של dulbecco (DMEM): מדיום F12 המכיל 0.7 מ"ג/מ"ל מעכב טריפסין מסוג II. סנן את התמיסה באמצעות מסנן 0.2 מיקרומטר.
6. הכן תמיסת PBS 0.6% גלוקוז לאיסוף המוח ותמיסת PBS 0.15% אלבומין בסרום בקר (BSA) לשלבי שטיפה ולצביעת נוגדנים.
7. הכן כלי חיתוך: מספריים, מלקחיים לניתוח וקשירה ואזמל. משרים אותם ב-70% אתנול.

2. קצירת מוחות של עכברים בוגרים ומיקרו-דיסקציות SVZ

1. להקריב עכברים בוגרים (בני 2 עד 3 חודשים ו/או 12 חודשים למחקרי הזדקנות), ביצוע פריקת צוואר הרחם בהתאם להנחיות המוסדיות המתאימות.
2. מרססים את העכבר באתנול 70% וחותכים את הראש בעזרת מספריים חדים.
3. בצע חתך לאורך הקרקפת כדי לחשוף את הגולגולת.
4. בצע חיתוך קו אמצע אורכי החל מבסיס הגולגולת לכיוון נורות הריח בעזרת מספריים קטנים. הקפד להימנע מפגיעה במוח הבסיסי עם להבי המספריים. הסר את החלק הפתוח העליון של הגולגולת בעזרת מלקחיים מעוקלים כדי לחשוף את המוח.
5. אסוף את המוח בצלחת פטרי 15 מ"מ המכילה 0.6% גלוקוז ב-PBS.
6. נתח את נורות הריח. הניחו את המוח על פני הגב שלו וצרו חתך עטרה דרך הכיאזמה האופטית באמצעות אזמל.
7. תחת מיקרוסקופ מנתח, מקם את החלק הרוסטרלי של קטע המוח כאשר משטח העטרה החתוך פונה כלפי מעלה לכיוון הנסיין.
8. כדי לנתח את ה-SVZ, הסר את המחיצה בעזרת מלקחיים מעוקלים עדינים, ולאחר מכן הכנס קצה אחד של מלקחיים עדינים לסטריאטום הסמוך לחדר ונתק את ה-SVZ מהרקמה שמסביב. מניחים את ה-SVZ המנותח בצלחת פטרי המכילה 1 מ"ל PBS-0.6% גלוקוז.

3. SVZ Tissue Dissociation

1. טוחנים את ה-SVZ המנותח בצלחת הפטרי עד שלא נשארים חתיכות גדולות.
2. העבירו את הרקמה הטחונה יחד עם PBS-0.6% גלוקוז לצינור של 15 מ"ל וצנטריפוגה ב-200 x גרם למשך 5 דקות.
3. השליכו את הסופרנטנט והוסיפו 1 מ"ל פפאין מחומם מראש (1 מ"ג/מ"ל, הוכן בשלב 1.4) בתוספת 0.01 מ"ג/מ"ל DNase I. דגירה למשך 10 דקות באמבט מים ב-37 מעלות צלזיוס. השתמש ב-1 מ"ל פפאין לכל עכבר.
4. צנטריפוגה בחום של 200 x גרם למשך 5 דקות והשליכו את הסופרנטנט.
5. יש להוסיף 1 מ"ל של אובומוקואיד שחומם מראש (0.7 מ"ג/מ"ל, מוכן בשלב 1.5) כדי להפסיק את פעילות הפפאין. נתק מכנית את הרקמה הטחונה עוד יותר לתרחיף חד-תאי על ידי פיפטינג עדין למעלה ולמטה 20 פעמים דרך קצה מיקרופיפטה p1000. הימנע מבועות אוויר.
6. העבירו את תרחיף התאים דרך מסנן סטרילי של 20 מיקרומטר בצינור חדש של 15 מ"ל. הקפד לשטוף את מסנן התאים עם PBS 0.15% BSA כדי למנוע אובדן תאים.
7. צנטריפוגה בחום של 200 x גרם למשך 10 דקות והשליכו את הסופרנטנט. השעו מחדש את התאים ב-100 מיקרוליטר של PBS המכילים 0.15% BSA.

4. צביעה אימונו-פלואורסצנטית למיון תאים

למיון תאים באמצעות עכברי FUCCI-Red (איור 1A), השתמש בנוגדנים הבאים: CD24 phycoerythrin-cyanine7 מצומד [PC7]; CD15/LeX פלואורסצאין איזותיוציאנט [FITC] מצומד וליגנד EGF מצומד Ax647.

הערה: LeX⁺EGFR⁺ ותאי EGFR⁺ אינם נמצאים בשפע ב-SVZ למבוגרים: ≈ 600 ו-1500 תאים/עכבר, בהתאמה. אנו ממליצים לאגד תאי SVZ מ-2 עד 3 עכברים כדי שיהיה מספיק חומר. אל תעבוד עם יותר מ-12 עכברים באותו יום כך שמשך מיון התאים לא יעלה על 3 שעות. זכור שעבודה עם יותר מדי עכברים באותו יום תוביל להארכת משך מיון התאים, מה שעלול לגרום למוות מוגבר של תאים ו/או להתמיינות תאים.

1. בצע את צביעת ה-FACS ב-100 מיקרוליטר של PBS 0.15% BSA לכל עכבר (או ב-200 מיקרוליטר עבור קבוצה של 2 עד 3 עכברים לצביעה אופטימלית).
2. הכן את צינורות הבקרה. השתמש בחרוזי פיצוי להכנת צינורות בקרה בצבע יחיד בהתאם לפרוטוקול היצרן. בחר חלק של תאים (1/10 מהתאים שחולצו מעכבר אחד מספיק) והפרד אותו ב-4 צינורות כדי להכין צינור בקרה שלילי אחד (תאים לא מסומנים) ו-3 צינורות בקרה פלואורסצנטיים מינוס אחד (FMO). השעו מחדש את התאים ב-200 מיקרוליטר של PBS 0.15% BSA לכל צינור.
   רמז: עבור בקרת LeX-FITC FMO, סמן את התאים עם CD24-PC7 (1:50) וליגנד EGF מצומד Ax647 (1:200); לבקרת CD24-PC7 FMO, סמן את התאים עם CD15/LeX-FITC (1:50) וליגנד EGF מצומד Ax647 (1:200) ועבור בקרת EGF ligand FMO מצומד Ax647, סמן את התאים עם CD15/LeX-FITC (1:50) ו-CD24-PC7 (1:50).
3. עבור הצינורות המשמשים למיון תאים, השתמש בנוגדנים הבאים בדילול המצוין ב-PBS 0.15% BSA: CD24-PC7 (1:50), CD15/LeX-FITC (1:50) וליגנד EGF מצומד Ax647 (1:200).
4. יש לדגור במשך 20 דקות בחום של 4 מעלות צלזיוס בחושך. שטפו עם 1 מ"ל PBS 0.15% BSA וצנטריפוגה ב-200 x גרם למשך 10 דקות. השעו מחדש את התאים ב -200 מיקרוליטר של PBS 0.15% BSA למוח. שמור את צינורות מיון התאים על קרח והמשך מיד למיון התאים.
5. אם משתמשים בעכברים FUCCI-Green, הפרד בין שברים חיוביים ל-LeX ושליליים באמצעות עמודות הפרדה לפני מיון התאים, מכיוון שהנוגדן LeX-FITC חולק את אותו אורך גל פליטה כמו הקרינה הירוקה של FUCCI (איור 2A, B).
   1. ראשית, סמנו את התאים עם נוגדן LeX אנטי-אנושי של עכבר (1:50) למשך 15 דקות ב-4 מעלות צלזיוס בחושך ב-100 מיקרוליטר של PBS 0.15% BSA.
   2. שטפו את התאים עם 1 מ"ל PBS 0.15% BSA וצנטריפוגה ב-200 x גרם למשך 10 דקות, ולאחר מכן סמנו את התאים במיקרו-חרוזי IgM נגד עכבר (1:10) למשך 15 דקות ב-4 מעלות צלזיוס בחושך.
   3. שוטפים את התאים עם 1 מ"ל PBS 0.15% BSA וצנטריפוגה ב -200 x גרם למשך 10 דקות. השעו מחדש את התאים ב-500 מיקרוליטר PBS 0.15% BSA ושפכו את התאים דרך עמודת ההפרדה בשדה המגנטי כפי שסוכם ב-איור 2C. שטפו את העמודה עם 1 מ"ל PBS 0.15% BSA כדי לקבל חלק שלילי של LeX.
   4. כדי להשיג שבר חיובי ל-LeX, הסר את עמודת ההפרדה מהשדה המגנטי והוציא את התאים עם 2 מ"ל PBS 0.15% BSA.
   5. המשך לצביעה של ליגנד EGF מצומד CD24-PC7 ו-Ax647 כפי שמצוין ב-4.2.

5. מיון תאים

הערה: התאים מוינו על סדרן FACS ב-40 Psi עם זרבובית של 86 מיקרומטר. הקרינה נאספה באמצעות ערכת המסננים הבאה: 520/35 ננומטר (FITC), 575/26 ננומטר (PE), 670/20 ננומטר (Ax647) ו-740LP (PC7). פיצוי נחוץ כדי למנוע אותות חיוביים כוזבים מכיוון שנמצאה חפיפה בין ספקטרום הפליטה של הקרינה האדומה FUCCI לבין צבע PC7.

1. מיד לפני מיון התאים, יש להוסיף צבע חיוני כדי להבחין בין תאים חיים לתאים מתים. השתמשנו ב-Hoechst (HO) ( ראה טבלת חומרים) בריכוז סופי של 2 מיקרוגרם/מ"ל. העבירו את צינור הבקרה השלילי (תאים לא מסומנים) דרך סדרן ה-FACS ובחרו את התאים באמצעות פרמטרים של פיזור צד (SSC) ופיזור קדימה (FSC) (איור 3A).
   הערה: תאים מתים לא נכללו על ידי שער רק של השבר השלילי HO (איור 3A), ולאחר מכן לא נכללו על ידי בחירת השבר השלילי של רוחב הדופק (איור 3A).
2. הפעל את פקדי הצבע היחיד שהוכנו בשלב 4.2 והתאם את מתחי שפופרת מכפיל הפוטו (PMT) במידת הצורך (כלומר אוכלוסייה שלילית גבוהה מדי ו/או תאים חיוביים מחוץ לקנה מידה). בצע פיצוי צבע בחלון הפיצוי של התוכנה.
3. הפעל פקדי FMO שהוכנו בשלב 4.2 (בקרת LeX-FITC FMO, בקרת CD24-PC7 FMO ובקרת EGF ligand FMO מצומדת Ax647) ושרטט את שערי המיון (איור 3). מיין את התאים ישירות ל-100 מיקרוליטר של מדיום תרבית במיקרו-צינורות של 1.5 מ"ל.

6. הכנת תאים למיקרוסקופיה

1. צלחת את התאים הממוינים הטריים בצפיפות של 1 - 3 x 10³ תאים/באר על צלחת μ מצופה פולי-D-ליזין 96 בארות עם 300 מיקרוליטר של מדיום תרבית.
2. לפני מיקרוסקופ וידאו, דגרו את לוחות התרבית ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO₂ למשך שעה אחת לפחות כדי לאפשר הידבקות תאים.

7. הגדרת מיקרוסקופ ורכישת תמונה

1. בצע הדמיה חיה באמצעות אובייקט Plan Apo VC 20x DIC (NA: 0.75) על מערכת מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלית המחוברת לתא תרמוסטאט הפוך ב-37 מעלות צלזיוס תחת אטמוספירה של 5% CO₂.
2. מקם את צלחת μ 96 הבארות בתוך תא התרמוסטט המחומם והמאוזן מראש והחלף את המכסה במכסה תרמוסטד.
3. פתח את תוכנת NIS-Elements ולחץ בשורת התפריטים על "בקרות רכישה/רכישה/רכישת ND" כדי לבחור את האפשרויות של זמן-lapse (אורך, מיקומי שלב, חתכי z קונפוקליים,...), "בקרות רכישה/רכישה/Ti Pad" כדי לבחור את היעדים ו"בקרות רכישה/רכישה/הגדרות A1plus" כדי לבחור את רמת ה-PMT עבור כל פלואורסצנטיות בשורת התפריטים. בחר תיקיה לשמירת קבצי הנתונים.
4. באמצעות חלון רכישת ND, הגדר את המרכז של כל באר כ-tagמיקום ובחר באפשרות התמונה הגדולה ל-7 x 7 מ"מ. זה ייצור תמונת פסיפס סביב מרכז כל באר. קבעו את החפיפה לתמונת הפסיפס הגדולה על 5%. צלם תמונות כל 20 דקות למשך 24 שעות. בחר את המטרה Plan Apo VC 20x DIC (NA: 0.75) בחלון Ti Pad.
5. בחלון הגדרות A1plus, רכוש תמונות באמצעות סורק תהודה מהיר בפורמט 512 x 512 פיקסלים ברזולוציה של 1.26 מיקרומטר/פיקסל. השתמש בשדה בהיר כדי להציג צורות תאים באופן חזותי. במקרה של עכברי FUCCI-Red, מעוררים פלואורסצנטיות אדומה ב-561 ננומטר ואוספים באמצעות מסנן 595/50 ננומטר. במקרה של עכברי FUCCI-Green, מעוררים פלואורסצנטיות ירוקה ב-488 ננומטר ואוספים באמצעות מסנן 530/40 ננומטר. קבע את רמת ה-PMT, ההיסט ועוצמת הלייזר האופטימליים עבור כל אורך גל.
   הערה: אנו ממליצים להשתמש בפונקציית המיקוד האוטומטי עבור ערוץ השדה הבהיר כדי לאפשר לתוכנה להתמקד אוטומטית בכל מיקום שלב לפני כל רכישה. רמז: יעד Plan Apo VC 20x DIC (NA: 0.75) שימש לרזולוציה המצוינת שלו ללא צורך בנפט. ניתן להשתמש במטרות אחרות בהתאם לרזולוציה האופטית הרצויה.
6. בחר בלחצן 'הפעל עכשיו' בחלון רכישת ND כדי להתחיל ברכישה.

תוצאות

איור 1: ניתוחים חיים של מחזור התא באמצעות עכברי FUCCI-Red. (A) ייצוג סכמטי של מחזור התאים FUCCI-Red, שבו התאים הם אדומים-פלואורסצנטיים במהלך ה-G_חד פאזי וחסר צבע במהלך שלבי S-G₂/M. (B) ייצוג FACS של פלואורסצנטיות FUCCI-R...

חומרים