הדמיית סידן מיקרואנדוסקופית בזמן אמת בעכבר הנע בחופשיות

תקציר

מקור: Lee, H. et. al., הדמיית סידן מוצלחת in vivo עם מיקרוסקופ ממוזער המותקן על הראש באמיגדלה של עכבר שמתנהג בחופשיות. J. Vis. Exp. (2020)

סרטון זה מדגים הדמיית סידן in vivo בעכבר באמצעות מקדם שבירה שיפוע, או עדשת GRIN, ומיקרוסקופ ממוזער. המערך משלב קיבוע ראש בתוך מערכת כלובים ניידת ללא חיכוך, מגרה נוירונים ומעורר זרם יוני סידן. עדשת GRIN לוכדת איתות סידן במוח, ומאפשרת הדמיה בזמן אמת של פעילות עצבית.

פרוטוקול

כל ההליכים הכוללים מודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ומועצת הביקורת הווטרינרית של JoVE.

הערה: פרוטוקול זה מורכב משישה שלבים עיקריים: ניתוח הזרקת וירוסים, ניתוח השתלת עדשות מקדם שבירה שיפוע (GRIN), אימות השתלת עדשת GRIN, חיבור לוחית בסיס, הקלטה אופטית של אות GCaMP (היתוך של חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP), קלמודולין (CaM) ו-M13, רצף פפטידים מקינאז שרשרת אור מיוזין) במהלך בדיקת התנהגות, ועיבוד נתונים (איור 1A). למעט ניתוחים, נעשה שימוש בחבילת התוכנה המסחרית (Inscopix).

1. ניתוח סטריאוטקסי - הזרקת וירוס הקשור לאדנו (AAV) <br />הערה: זן העכבר המשמש בהליך כירורגי זה הוא C57BL6/J. גוף החיה מכוסה בווילון סטרילי במהלך הניתוח, וכל השלבים בפרוטוקול מבוצעים עם לבישת כפפות סטריליות. ניתוחים מרובים בדרך כלל אינם מבוצעים באותו יום. עם זאת, אם מספר עכברים צריכים לעבור את אותו ניתוח באותו יום, השתמש בסט נפרד של כלים כירורגיים אוטומטיים לכל עכבר ו-70% אתנול כדי לחטא את מכשירי הניתוח בין עכברים. כדי לשמור על חום העכבר במהלך ההליך הכירורגי, העכבר מכוסה בשמיכה כירורגית בהתאמה אישית לאחר קיבוע למסגרת הסטריאוטקסית.

1. חטאו את כל כלי הניתוח הנדרשים עם 70% אתנול, והכינו מזרק המילטון ופיפטה מזכוכית. מלאו את פיפטת הזכוכית במים מזוקקים.
   הערה: כל הכלים הכירורגיים המשמשים בפרוטוקול עוברים חיטוי. מכיוון שלא ניתן לבצע חיטוי של עדשת GRIN וברגי הגולגולת לצורך עיקור, 70% אתנול משמש כחומר חיטוי למניעת דלקת. למרות שלא נוסה, ניתן להשתמש בצורות אחרות של עיקור כגון עיקור גז או כימיקלים.
2. להרדים את העכבר עם פנטוברביטל (83 מ"ג∙ק"ג-1 ממשקל הגוף) על ידי הזרקה תוך-צפקית. לאחר שהעכבר מאבד את ההכרה, גלחו את הפרווה על הגולגולת.
3. נקו את העור מעל הגולגולת עם 70% אתנול וקבעו את העכבר למסגרת הסטריאוטקסית. הסר בזהירות את העור ונגב את פני הגולגולת בתמיסת מי חמצן 35% בעזרת אפליקטור כותנה. מרחו משחת עיניים למניעת התייבשות הקרנית במהלך הניתוח.
   הערה: למרות שבדרך כלל אין בעיה להשתמש באתנול 70% רק להכנת עור אספטי, מומלץ להשתמש ב-3 סבבים לסירוגין של חומר חיטוי כגון יודופור או תמיסת כלורהקסידין, ו-70% אתנול. ריכוז גבוה יותר של מי חמצן משמש בפרוטוקול זה כדי לוודא שרקמת החיבור על גולגולת העכבר מוסרת באופן מלא ככל האפשר, וזה קריטי להפחתת חפצי תנועה במהלך הדמיה מאוחרת יותר מכיוון שרקמת החיבור על הגולגולת מפריעה לחיבור יציב של לוחית הבסיס לגולגולת. יש לציין כי 35% מי חמצן גבוה בהרבה ממה שמשתמשים בו בדרך כלל (3%).
4. תקן את הסיכה עם מחזיק בדיקה סטריאוטקסי. יישר את גובה הברגמה והלמבדה עם הסיכה.
5. מצא את המיקום הספציפי בגולגולת העכבר לקרניוטומיה.
   הערה: הקואורדינטות של האמיגדלה הרוחבית (LA) להזרקת וירוסים הן (AP, ML, DV) = (-1.6 מ"מ, -3.5 מ"מ, -4.3 מ"מ) מברגמה בפרוטוקול זה (AP; קדמי-אחורי, ML; מדיאלי-לטרלי, DV; גבי-גחון, כל קיצור מציין מרחק צירי יחסי מהברגמה). יש לבצע אופטימיזציה של הקואורדינטות עבור כל תנאי ניסוי.
6. קדחו את משטח הגולגולת (איור 1B). שטפו את שברי הגולגולת עם מי מלח עם חוצץ פוספט (PBS). הסר את השכבה הנותרת באמצעות מלקחיים או מחט 27 גרם.
   1. בעת קידוח הגולגולת, נסה לא לגעת בשכבת הדורה האחרונה כדי להימנע מפגיעה במשטח רקמת המוח. משטח מוח פגום גורם לדלקת סביב העדשה, מה שגורם לחפצי תנועה חמורים ולאוטופלואורסצנטיות גבוהה במהלך ההקלטה. הגולגולת היא 1.6 מ"מ. מהירות המקדחה היא 18,000 סל"ד, וגודל הסיביות הוא 0.6 מ"מ.
7. להורדת עדשת ה-GRIN משטח רקמת המוח של האתר הקדוח לאתר האמיגדלה המטרה, חשב את המרחק המכונה "ערך A" על ידי הפחתת הפרש ה-DV בין הברגמה למשטח המוח החשוף מקואורדינטות ה-DV של השתלת העדשה, שנקבעה על סמך הברגמה (4.2 מ"מ במקרה זה, איור 1C).
8. טען 3 מיקרוליטר שמן מינרלי ו-0.7 מיקרוליטר של תמיסת וירוס AAV בפיפטה הזכוכית.
   הערה: שמן מינרלי עוזר להפריד בין תמיסת וירוס ומים. 0.7 מיקרוליטר הוא נפח אופטימלי להזרקת נגיף LA שיכול לכסות את ה-LA.
9. הסר את הסיכה ממחזיק הבדיקה הסטריאוטקסית וקבע אליו את פיפטת הזכוכית.
10. אתר את פיפטת הזכוכית באתר ההזרקה המוזכר בשלב 1.5. הכנס את פיפטת הזכוכית לרקמת המוח לאחר הפסקת הדימום לחלוטין.
11. העבירו את הנגיף דרך פיפטת זכוכית באמצעות משאבת הזרקה.
    הערה: טיטר הנגיף צריך להיות גבוה מ-1 x 1013 vg/mL כדי להשיג מספר מספיק של תאים המבטאים GCaMP. מהירות ההזרקה היא 0.1 μL/min ומפוזרת למשך 10 דקות. אם יש דימום, שטפו את פני המוח עם PBS. שמור על משטח המוח רטוב בשלב זה.
12. לאחר סיום ההזרקה, הסר את פיפטת הזכוכית לאט.

2. ניתוח סטריאוטקסי - השתלת עדשת GRIN
הערה: ניתוח השתלת עדשות GRIN הוא השלב הקריטי ביותר בפרוטוקול זה. מכיוון שמהירות איטית עקבית של תנועת עדשת GRIN היא קריטית להשתלת עדשת GRIN מוצלחת, זרוע ניתוח ממונעת יכולה להיות שימושית. זרוע הניתוח הממונעת היא מניפולטור סטריאוטקסי הנשלט על ידי תוכנת מחשב. למרות שהזרוע הממונעת משמשת בפרוטוקול זה, ניתן להשתמש גם בדרכים אחרות כל עוד העדשה נעה באופן עקבי ואיטי במהלך ההשתלה. מידע מפורט על המכשיר נמצא בטבלת החומרים.

1. קדחו את הגולגולת כדי להשתיל שני ברגי גולגולת. שטפו את כל שברי הגולגולת עם PBS.
   הערה: כדי להפחית את חפצי התנועה בהדמיה אופטית מאוחרת יותר, נדרשים לפחות שני ברגים. שני ברגי הגולגולת ומיקום שתל עדשת GRIN יוצרים משולש שווה צלעות (איור 1B). גודל הגולגולת צריך להתאים היטב לקוטר הבורג. אם יש דימום, יש לשטוף את משטח הדימום עם PBS. מהירות המקדחה היא 18,000 סל"ד, וגודל הסיביות הוא 0.6 מ"מ.
2. חיטוי הברגים עם 70% אתנול למניעת דלקת. השתל את הברגים עמוק ככל האפשר.
   הערה: יש לקבע את הברגים היטב ללא הידבקות נוספת, כגון מלט.
3. התקן זרוע כירורגית ממונעת על המסגרת הסטריאוטקסית. חבר את החומרה הנדרשת למחשב הנייד בו מותקנת תוכנת בקרה (טבלת חומרים).
4. לפני הורדת עדשת ה-GRIN, התכוננו ליצור מסלול מחט עם מחט 26 גרם.
   הערה: מסלול המחט הוא מעין מסלול מנחה המסייע להשתיל את עדשת ה-GRIN העבה יחסית באזורי מוח עמוקים כמו האמיגדלה מבלי לגרום לעיוות חמור של מבנה המוח לאורך נתיב ההזרקה. מסלול מנחה זה נקרא מסלול מחט מכיוון שהוא מיוצר על ידי הליך הורדה והרמה של מחט דקה יחסית של 26 גרם.
5. חבר את מחזיק הצינורית כדי להחזיק ביציבות את המחט על המסגרת הסטריאוטקסית.
6. אחוז במחט 26 G עם מחזיק הצינורית וחשב את הקואורדינטות של אתר החדרת המחט.
   הערה: בפרוטוקול זה, הקואורדינטות של אתר החדרת המחט הן 50 מיקרומטר לרוחב מאתר הזרקת הנגיף (AP, ML, DV) = (-1.6 מ"מ, -3.55 מ"מ, -3.7 מ"מ).
7. גש לתוכנת הבקרה והכנה מלאה למניפולציה של מיקום המחט.
   1. הפעל את תוכנת הבקרה ובחר בלחצן התחל פרויקט חדש כדי להתחיל את הפעלת הבקרה.
      הערה: בפגישת הבקרה, ישנן מספר תיבות ריקות וכפתורי תפריט. התיבות הריקות הן מרחבי קלט עבור קואורדינטות. לאחר הזנת קואורדינטות בתיבות הריקות, הזרוע הסטריאוטקסית הממונעת נעה על ידי לחיצה על כפתור Go To. כפתור Go To משתנה לכפתור STOP כאשר הזרוע הסטריאוטקסית נעה. מבין מספר כפתורי תפריט, רק כפתור הכלי נדרש בפרוטוקול זה.
   2. לחצו על הלחצן 'כלי'. כייל את תוכנת הבקרה על ידי לחיצה על כיול המסגרת לחצן. כיול הוא התהליך שבו המיקום בפועל של המניפולטור מוגדר כערכים בתוכנת Stereodrive.
8. אתר את קצה המחט במשטח המוח החשוף על פני הגולגולת באמצעות מניפולטור סטריאוטקסי.
   הערה: מהירות המחט מוגדרת באמצעות תפריט המהירות של Microdrive בתפריט הכלי. מהירות ברירת המחדל היא 3.0 מ"מ לשנייה. עם זאת, מהירות של 0.5 מ"מ לשנייה מומלצת בשלב זה. תנועת המחט נשלטת על ידי מקשי החצים.
9. הוסיפו 2-3 טיפות PBS כדי לשמור על משטח המוח רטוב. מלא את התיבה הריקה במסך המחשב עם קואורדינטות DV מתאימות של רשות התעופה LA. אם פני המוח יבשים, זה מעכב את חדירת המחט לרקמת המוח.
10. הורד את מחט ה-26 G על ידי לחיצה על עבור אל לחצן. הוא נעצר אוטומטית כאשר המחט מגיעה לאתר היעד שנקבע על ידי קואורדינטות DV. מהירות המחט היא 100 מיקרומטר לדקה. אם יש דימום, עצרו את המחט על ידי לחיצה על כפתור STOP ושטפו את פני המוח עם PBS. שמור על משטח המוח רטוב בשלב זה. לאחר הפסקת הדימום, התחל להוריד שוב.
11. לאחר שהמחט מפסיקה לנוע, הזן 45.00 מ"מ בתיבה הריקה על מסך המחשב.
    הערה: 45.00 מ"מ הוא ערך של קואורדינטות DV שגורם למחט לחזור למצב ההתחלה.
12. הרם את המחט על ידי לחיצה על עבור אל לחצן. מהירות תנועת המחט היא 100-200 מיקרומטר לדקה.
13. אחרי שהמחט מפסיקה לנוע, הסירו את ה-PBS על פני השטח של המוח. הסר את ההתקנה של המחט ומחזיק הצינורית מהמסגרת הסטריאוטקסית. הנסיין יכול לעצור את המחט באופן ידני על ידי לחיצה על כפתור STOP בעת הצורך.
14. ציידו את המוט הסטריאוטקסי במחזיק העדשה. התקן את עדשת ה-GRIN על מחזיק העדשה.
    הערה: עדשת ה-GRIN המותאמת למיקוד ב-LA (קוטר 0.6 מ"מ, אורך 7.3 מ"מ) משמשת בפרוטוקול זה. אם מחזיק העדשה אינו מוכן, דרך חלופית היא להשתמש בקליפס בולדוג כדי לאחוז בעדשת ה-GRIN.
15. חיטוי העדשה עם 70% אתנול והצמדת המוט הסטריאוטקסי למסגרות הסטריאוטקסיות.
16. אתר את קצה עדשת ה-GRIN באתר המיועד על פני הגולגולת (אותה שיטה המתוארת בשלב 2.8).
    הערה: הקואורדינטות של עדשת ה-GRIN הן (AP, ML, DV) = (-1.6 מ"מ, -3.55 מ"מ, -4.2 מ"מ) (איור 1C). העדשה לא צריכה לגעת בגולגולת כדי למנוע נזק לקצה שלה.
17. חשב את קואורדינטת ה-DV על ידי הפחתת הערך המוחלט של "ערך A" מקואורדינטות ה-DV של השתלת העדשה המתוארת בשלב 2.16.
18. יש לטפטף 2-3 טיפות של PBS על פני המוח. הזן 1000 מיקרומטר להנמכה ו-300 מיקרומטר להרמת העדשה בתיבה הריקה על מסך המחשב.
19. חזור על ההורדה (1000 מיקרומטר כלפי מטה) והעלאה (300 מיקרומטר כלפי מעלה) של עדשת ה-GRIN עד שהיא מגיעה לאתר היעד. הליך זה למעלה ולמטה משמש כדי לסייע בשחרור הלחץ שנוצר בתוך רקמת המוח עקב הליך ההורדה של העדשה שאחרת עלול לגרום לעיוות של מבני המוח לאורך נתיב ההשתלה.
    הערה: מהירות תנועת עדשת ה-GRIN היא 100 מיקרומטר/דקה. גם אם יש דימום, אל תפסיקו להזיז את עדשת ה-GRIN ושטפו את פני המוח עם PBS. שמור על משטח המוח רטוב בשלב זה. אם פני המוח יבשים, רקמת המוח נדבקת למשטח עדשת ה-GRIN וזה גורם לעיוות של מבנה המוח.
20. אם עדשת ה-GRIN מגיעה לאתר המטרה, הסר PBS והחל בזהירות את צמנט השרף הדנטלי סביב עדשת ה-GRIN, הברגים והדופן שלהם (איור 1D).
    הערה: מריחת מלט השרף על כל הגולגולת עשויה להפחית את חפצי התנועה. נהפוך הוא, אם מלט השרף מכסה בטעות את השרירים המחוברים לגולגולת, הוא מגביר את חפצי התנועה.
21. לאחר שצמנט השרף מתקשה, פרק את עדשת ה-GRIN ממחזיק העדשה ומרח צמנט אקרילי על כל הגולגולת (איור 1D).
22. כדי לחבר את לוחית הראש, פרק את מחזיק העדשה מהמוט הסטריאוטקסי והצמד את לוחית הראש בקצה המוט באמצעות סרטים. ודא אם לוחית הראש אופקית.
    הערה: לוחית ראש מוטה גורמת להטיה view. נדרשת לוחית ראש לקיבוע ראש העכבר במערכת הכלוב הביתי הנייד (בקטע חיבור לוחית הבסיס). אם הנסיין אינו משתמש במערכת, דלג על שלב זה (שלב 2.22) ועל שלב 2.23 הבא.
23. הורד לאט את המוט עד שלוחית הראש ממוקמת בחלק העליון של שרוול העדשה. הורד את לוחית הראש ב -1000 מיקרומטר יותר. הזז את לוחית הראש של עדשת ה-GRIN המושתלת כדי למקם בקצה הימני של הטבעת הפנימית של לוחית הראש.
    הערה: יש למקם את לוחית הראש נמוך יותר ממשטח עדשת ה-GRIN המושתלת; אחרת, המיקרואנדוסקופ לא יכול להתקרב מספיק לעדשת ה-GRIN המושתלת להתאמת מישור המוקד עקב מלט האקריל.
24. מרחו צמנט אקרילי כדי לחבר את לוחית הראש לשכבות המלט (איור 1D).
25. חבר סרט פרפין על משטח עדשת ה-GRIN המושתל כדי להגן על משטח העדשה מפני אבק. לאחר מכן מרחו קשר אפוקסי נשלף על סרט הפרפין כדי לשמור על סרט הפרפין על משטח העדשה.
26. יש להזריק קרפרופן, משכך כאבים (0.5 מ"ג/מ"ל ב-PBS), ודקסמתזון, תרופה אנטי דלקתית (0.02 מ"ג/מ"ל ב-PBS), בחלל הצפק של העכבר.
    הערה: מינון התרופה תלוי במשקל הגוף: קרפרופן (5 מ"ג-ק"ג-1 ממשקל הגוף) ודקסמתזון (0.2 מ"ג-ק"ג-1 ממשקל הגוף). גם קרפרופן וגם דקסמתזון ניתנים לאחר הניתוח ופעם ביום במשך 7 ימים לאחר הניתוח.
27. יש לערבב 0.3 מ"ג/מ"ל אמוקסיצילין, אנטיביוטיקה, במי כלוב ביתי כדי לתת את התרופה למשך שבוע.
28. החזר את העכבר לכלוב הביתי ואפשר 5-8 שבועות להתאוששות והעברת וירוסים.
    הערה: העכבר מתאושש בכלוב שחומם מראש על שמיכה חשמלית עד שהעכבר מתעורר מההרדמה.

3. אימות השתלת עדשת GRIN
הערה: אימות השתלת עדשת GRIN מספק מידע על האם עדשת ה-GRIN המושתלת מכוונת לתאים המבטאים GCaMP. בהתבסס על מידע זה, הנסיין חוסך את זמנו מתהליכים גוזלי זמן כגון מבחן התנהגות ועיבוד נתונים על ידי אי הכללת בעלי חיים עם השתלת עדשת GRIN לא ממוקדת. במהלך הליך האימות, תאים עם ביטוי GCaMP צריכים להיות ממוקדים בשדה הראייה של ההקלטה. בשלב זה משתמשים בכלוב בית נייד. כלוב בית נייד הוא מכשיר מיוחד בצורת עגול המאפשר לעכברים קבועי ראש להזיז את רגליהם בחופשיות במהלך אימות השתלת עדשת GRIN וחיבור לוחית הבסיס. שולחן הרמת אוויר במנגנון זה, שעליו מונחות רגליהם של עכברים קבועים בראש, מאפשר תנועה חופשית כזו של הרגליים, למרות שהראש קבוע. התאים בגרעין הצדדי של האמיגדלה בדרך כלל שקטים במצב מנוחה או הרדמה, כך שאותות פלואורסצנטיים של GCaMP מזוהים לעתים רחוקות בתנאים אלה, מה שמקשה מאוד, לפעמים בלתי אפשרי, למצוא תאים המבטאים GCaMP במהלך אימות השתלת עדשת GRIN וחיבור לוחית הבסיס. עם זאת, תנועת הרגליים מייצרת לעיתים קרובות אותות פלואורסצנטיים של GCaMP בתאים של הגרעין הצדדי של האמיגדלה, ובכך יכולה לסייע באיתור המיקרוסקופ. לפיכך, כלוב הבית הנייד משמש בפרוטוקול זה.

1. הרכיבו את המניפולטור הסטריאוטקסי למערכת כלובי הבית הנייד.
2. להרדים את העכבר עם 1.5% גז איזופלורן. לאחר שהעכבר מחוסר הכרה לחלוטין, הנח את העכבר על מוט הראש של מערכת הכלובים הביתית הניידת.
3. אתר את כלוב הפחמן מתחת לעכבר. סגור את כלוב הפחמן והפעל את זרימת האוויר כדי לגרום לכלוב לנוע בחופשיות ללא חיכוך. המתן מספר דקות עד שהעכבר יהפוך לפעיל.
   הערה: יש לייעל את מהירות זרימת האוויר לכל מצב ניסוי (כאן, 100 ליטר לדקה).
4. הסר את סרט הפרפין וקשר האפוקסי על פני עדשת ה-GRIN המושתלת ונגב את משטח העדשה ב-70% אתנול באמצעות נייר עדשה.
5. הכן את תוכנת רכישת הנתונים (DAQ) (למשל, Inscopix). הגדר את תנאי ההדמיה.
   הערה: תוכנת DAQ משמשת לשליטה במיקרוסקופ (עוצמת דיודה פולטת אור (LED), מיקוד עדשה וכו') ואחסון נתונים.
   1. הפעל את תיבת ה-DAQ וחבר אליה מיקרוסקופ. לאחר מכן, חבר אותו למחשב נייד ישירות באמצעות כבל או באמצעות אינטרנט אלחוטי.
      הערה: תוכנת DAQ מותקנת בחומרה הנוספת הנקראת DAQ box (למשל, Inscopix). על ידי חיבור תיבת ה-DAQ למחשב הנייד, תוכנת DAQ הופכת לנגישה במחשב נייד.
   2. גש לתוכנת DAQ דרך דפדפן אינטרנט (מומלץ להשתמש בפיירפוקס).
   3. הגדר את כל הפרטים הדרושים (תאריך, מזהה עכבר וכו') בהפעלה מוגדרת. לאחר מכן לחץ על שמור והמשך. לאחר השמירה, גש להפעלה.
   4. בסשן הריצה, הגדר את תנאי ההדמיה כגון זמן חשיפה, רווח, מיקוד אלקטרוני והספק LED חשיפה.
      הערה: הספק רווח וחשיפה-LED ניתנים לשינוי בהתאם לתנאי המעבדה. הערך המומלץ למיקוד חשמלי הוא 500 וזמן החשיפה הוא 50 אלפיות השנייה. אין הגבלה לשינוי הספק LED ורווח. עם זאת, עוצמת אור גבוהה יותר עלולה לגרום להלבנה רבה יותר. זמן החשיפה של ההקלטה קובע את קצב הפריימים של הקלטת הווידאו. קצבי פריימים גבוהים יותר יפחיתו את עוצמת האות. יש לבצע אופטימיזציה של קצבי פריימים עבור GECIs המשמשים להדמיה.
6. כדי להחזיק את המיקרוסקופ על מניפולטור סטריאוטקסי, חבר את המוט הסטריאוטקסי עם תופסן מיקרוסקופ למניפולטור הסטריאוטקסי.
   הערה: התפסן הוא אביזר קטן שניתן לחבר למנגנון הסטריאוטקסי כדי להחזיק גוף מיקרוסקופ להצבתו במיקום מוח המטרה.
7. אחוז במיקרוסקופ עם תופסת המיקרוסקופ. הפעל את נורת ה-LED המחוברת למיקרוסקופ ויישר את המיקרוסקופ אנכית. הורד את המיקרוסקופ תוך כדי התבוננות בתמונה עד להופעת פני השטח של עדשת GRIN מושתלת.
8. יישר את מרכז עדשת ה-GRIN המושתלת עם מרכז התצוגה.
   הערה: ניתן לבצע אימות של השתלת עדשת GRIN בשלב זה (מוזכר בסעיף התוצאות, איור 2B, איור 2D, איור 2F).
9. צלם תמונה של משטח עדשת ה-GRIN המושתל (לחץ על כפתור Prt Sc במקלדת). התמונה של משטח עדשת ה-GRIN המושתלת נדרשת לביטול בחירת רכיבים לא עצביים במהלך עיבוד נתונים מאוחר יותר (שלב 6.8).
10. מצא את המיקום המתאים של המיקרוסקופ. הרם לאט את עדשת האובייקט של המיקרוסקופ תוך התבוננות בתמונה כדי לחפש תאים עם ביטוי GCaMP7b.
    הערה: ייתכן שיהיה צורך להתאים את הרווח של רכישת התמונה או את עוצמת החשיפה-LED. ניתן לבצע אימות של השתלת עדשת GRIN בשלב זה (מוזכר בסעיף התוצאות, איור 2A, איור 2C, איור 2E).

תוצאות

איור 1: זרימת עבודה סכמטית ודיאגרמות עבור ניתוחים סטריאוטקסיים להדמיית סידן מיקרואנדוסקופית in vivo בלוס אנג'לס. (A) זרימת עבודה סכמטית של הדמיית סידן מיקרואנדוסקופית in vivo בלוס אנג'לס. (B) תמונה מיקרוסקופית שמראה קואורדינטות דו-ממדיות של אתרי קרניוטומ...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
26G מחט	BD	302002	ניתוח
AAV1-Syn-GCaMP7b-WPRE	Addgene	104493-AAV1	ניתוח
AAV2/1-CaMKiiα-GFP	ניתוח בהתאמה אישית
צמנט אקרילי-דנטלי (אורתו-ג'ט ורוד אקרילי)	Lang	1334-pink	ניתוח וחיבור לוחית בסיס
מניפולטור זרימת אוויר	Neurotar	NTR000253-04	חיבור לוחית בסיס
אמוקסיצילין	SIGMA	A8523-5G	ניתוח
כלוב פחמן	נוירוטאר	180 מ"מ x 70 מ"מ	חיבור לוחית בסיס
קרפרופן	SIGMA	PHR1452-1G	כירורגיה
תוכנה לעיבוד נתונים	INSCOPIX	INSCOPIX תוכנה לעיבוד נתונים	מבחן הצמדת לוחית בסיס והתנהגות
דקסמתזון	SIGMA	D1756-500MG	תרגיל ניתוח
	מרתון-4	ניתוח
מקדחה ELA		US1/2, Shank104	ניתוח
מחט זכוכית	WPI	PG10165-4	ניתוח
עדשת GRIN (INSCOPIX Proview Lens Probe)	INSCOPIX	1050-002208	ניתוח
מזרק המילטון	המילטון	84875	ניתוח
לוחית ראש	נוירוטאר	דגם 5	ניתוח
מחשב נייד	סמסונג	NT950XBV
מחזיק עדשה, מוט סטריאוטקסי (ערכת שתלים INSCOPIX proview)	INSCOPIX	1050-004223
תפסן מיקרוסקופ	INSCOPIX	1050-002199	מצורף ללוחית בסיס
, תוכנת DAQ, חומרה	INSCOPIX	nVista 3.0	מבחן הצמדת לוחית בסיס והתנהגות
כלוב ביתי נייד	Neurotar	MHC V5	חיבור לוחית בסיס
זרוע מוטרית	נוירוסטאר	ניתוח	מותאם אישית
תוכנת זרוע מוטרית	נוירוסטאר	ניתוח מותאם אישית
נשלף אפוקסי בונד	WPI	Kwik-Cast	ניתוח
שרף צמנט (סופר-בונד)	שמש רפואית	סופר בונד ניתוח C&B
בורג גולגולת	סטולטינג	51457	ניתוח
מסגרת סטריאוטקסית	סטולטינג	51600	ניתוח
מניפולטור	סטריאוטקסיStoelting	51600	חיבור לוחית בסיס

כירורגי מיקרוסקופ