הדמיה של מקלעת כורואיד במוח עכבר באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סורק

תקציר

מקור: Van Wonterghem, E., et al. מיקרודיסקציה ומיקרוסקופ אלקטרונים סריקה שלמה הדמיה של מקלעת כורואיד עכבר. J. Vis. Exp. (2022)

סרטון זה מדגים את ההכנה וההדמיה של רקמת מקלעת כורואיד ממוח עכבר באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סורק (SEM). התהליך כולל קיבוע רקמות, התייבשות וציפוי בשכבת פלטינה מוליכה לייצוב והכנת הדגימה להדמיה. SEM מצלם תמונות מפורטות של תאי אפיתל עם מיקרוווילי ומספק תובנות לגבי המאפיינים המבניים של הרקמה.

פרוטוקול

כל ההליכים הכוללים דגימות של בעלי חיים נבדקו ואושרו על ידי ועדת הביקורת האתית המתאימה לבעלי חיים.

1. ניתוח מורפולוגי של רקמת מקלעת כורואיד (CP) באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סורק (SEM)

זהירות: תמיסות רעילות משמשות בשלבי העיבוד הבאים. מומלץ לבצע את הכנת הדגימה במכסה אדים.

1. בצע הכנה לדוגמה עבור SEM כמתואר להלן.
   1. העבירו את ה-CP המבודד הטרי לתמיסת קיבוע טרייה המכילה 2% פרפורמלדהיד ו-2.5% גלוטראלדהיד במאגר Na-cacodylate 0.1 M (pH 7.4). דגירה למשך הלילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
      הערה: מכיוון שרקמת ה-CP שבירה ודקה מאוד, יש לשים את הרקמה בסלי דגימות קטנים (ראה טבלת חומרים) כדי להעביר אותה בין מאגרים. באופן זה, מבנה הרקמה יישמר טוב יותר. נעשה שימוש בקיבוע מבוסס קקודילאט על פני תמיסת מלח עם חוצץ פוספט (PBS), מכיוון שמאגר הקקודילאט החזק יכול להתמודד עם ה-pH הנמוך של גלוטרלדהיד בקיבוע EM.
   2. שטפו את הדגימה 3 פעמים למשך 5 דקות כל אחת עם 3-5 מ"ל של 0.1 M Na-cacodylate buffer (pH 7.4).
   3. לאחר תיקון הדגימות ב-3-5 מ"ל של 2% טטרוקסיד אוסמיום במאגר Na-cacodylate של 0.1 M למשך 30 דקות. שטפו את הדגימות 3 פעמים למשך 5 דקות כל אחת עם 3-5 מ"ל מים טהורים במיוחד.
   4. לייבש את הדגימות בסדרה של תמיסות קרות כקרח של עלייה בריכוזי אתנול (EtOH) (50%, 70%, 85%, 100%), למשך 15 דקות לכל תמיסת EtOH. השתמש במייבש נקודה קריטית כדי לייבש כראוי את הדגימה. הערה: המעבר משלב נוזל לגז משפיע על מתח הפנים, וגורם נזק למבנה פני השטח. שלב הייבוש הנקודתי הקריטי מאפשר שמירה על מבנה פני השטח.
   5. מקם את הדגימה בזהירות על תושבת דגימה שסופקה עם מדבקת פחמן (ראה טבלת חומרים).
   6. מצפים את הדגימות בשכבה דקה (2-5 ננומטר) של פלטינה. לשם כך, הרכיב מקור פלטינה במערכת ואקום בין שני מסופים חשמליים בעלי זרם גבוה וחמם את הפלטינה לטמפרטורת האידוי שלה. זרם עדין של פלטינה מופקד על הדגימה. הערה: מלבד פלטינה, ניתן להשתמש גם בזהב או בזהב/פלדיום.
2. דמיין את דוגמאות ה-CP עם SEM (ראה טבלת חומרים). הליך ההדמיה של רקמת CP via SEM דומה לזה של סוגים אחרים של רקמות ותלוי בתוכנה המשמשת ובמכשירים.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
תושבות דגימת אלומיניום EM	Sciences	75220
מאגר קקודילאט	EM Sciences	11652
לשוניות דבק פחמן -12 מ"מ	EM Sciences	77825-12
מייבש נקודה קריטית	Bal-Tec	CPD030
Crossbeam 540	Zeiss		SEM מערכת
מלקחיים	Fine Science Tools GmbH	91197-00
Glutaraldehyde	EM Sciences	16220
Osmium Tetroxide	EM Sciences	19170
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148
תמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS)	Lonza	BE17-516F
מניין פלטינה		Q150T ES	PBS ללא Ca⁺⁺, Mg⁺⁺ או פנול אדום;
סל דגימה	EM Sciences	70190-01

מסונן סטרילי נירוסטה