סרטון זה מדגים הדמיית סידן בזמן אמת כדי לנטר פעילות סינפטית בתאי עצב מוטנטיים של ALS המבטאים חיישן ביולוגי של סידן מקודד גנטית. הוא מתאר את השלבים להכנת הנוירונים להדמיה, גירוי דינמיקת סידן והקלטת פלואורסצנטיות כדי למדוד שינויים בזמן אמת ברמות הסידן התוך-תאי, המשקפות פעילות סינפטית עצבית.
Transfect נוירונים ראשוניים בקליפת המוח של מכרסמים שגודלו על צלחות תחתית זכוכית 35 מ"מ עם 500 ננוגרם של Gcamp6m. הערה: אם תרצה, טרנספקט משותף נוירונים עם פלסמיד מעניין המכיל תג פלואורסצנטי בטווח האדום או האדום הרחוק.
דגרו על תאי עצב עם נוזל מוחי מלאכותי (aCSF) עם אשלגן כלורי נמוך (KCl) (טבלה 1) למשך 15 דקות, 48 שעות לאחר הטרנספקציה, ואז הרכיבו את הצלחת על פלטפורמת ההדמיה.
דמיין את הקרינה GCaMP6m באמצעות מסנן פלואורסצאין איזותיוציאנט (FITC) (488 ננומטר) ומטרה של 20x או 40x.
בחר את שדה ההדמיה והפעל מיקוד מושלם. לאחר מכן, צלמו תמונת סטילס אחת עם ערוצי סמן שדה בהיר, FITC ופלואאורסצנטי כדי לסמן גבולות עצביים.
התחל הפעל עכשיו בתוכנת הרכישה. בצע את ההקלטה הבסיסית למשך 5 דקות ולאחר מכן השתמש ב-aCSF המכיל 50 מ"מ KCL (טבלה 1). הערה: מטרת הדמיה זו היא למדוד מעברי סידן מעוררים. אם לנוירון יש פעילות ירי בסיסית ושטפי סידן במהלך התקופה שלפני הגירוי, הוא אינו משמש בניתוח נתונים. במקום זאת, משתמשים רק בתאים עם פלואורסצנטיות רקע יציבה. ניתן גם להאריך את התקופות שלאחר הגירוי ל-60 דקות עבור מעברי סידן, עם או בלי זלוף רציף נוסף של KCl.
שמור את הניסוי ונתח נתונים באמצעות תוכנה קונפוקלית. ניתן להפסיק את הניסוי בשלב זה, וניתן לבצע את הניתוח מאוחר יותר. הערה: אם התאים אינם דורשים טרנספקציה לביטוי חלבונים מעניינים, ניתן לבצע פרוטוקול זה בכל נקודת זמן במבחנה כאשר מבקשים לבחון מעברי סידן. לאחר בדיקה של תאי בקרה כדי להבטיח מדידת מעברי סידן, יש לעוור את הנסיין לתנאים הגנטיים או הפרמקולוגיים של כל מנה שנבדקה כדי למזער הטיה.
2. ניתוח תמונות
פתח תמונות זמן-lapse עם תוכנה קונפוקלית.
יישור תמונות בסדרות דולג זמן לפי סדרת הפקודות: תמונה | עיבוד | ישר את המסמך הנוכחי. בחר Align to the First Frame.
בחר אזורי עניין (ROI) לאורך נויריטים באמצעות כלי בחירת ה-ROI, סמל בצורת שעועית בצד ימין של מסגרת התמונה. כמו כן, סמן החזר ROI המייצג את עוצמת הקרינה ברקע. הערה: החזר ROI נבחר על ידי בחירת אזורים של פונקטה מופרדת באופן מובהק לאורך מסלולים עצביים המצוינים על ידי תמונת הסטילס של השדה הבהיר. לפחות חמישה החזר ROI לכל נוירון נבחרים לניתוח. החזר ה-ROI של הרקע נבחר באזור של שדה הראייה שאינו מכיל נויריטים.
מדוד פלואורסצנטיות גולמית לאורך זמן עבור החזר ROI נבחר באמצעות סדרת הפקודות הבאה: מדידה | מדידת זמן.
הפעל את הפונקציה Measure בחלק העליון של החלונית Time Measurement. ייצוג גרפי של הקרינה הגולמית לאורך זמן ונתונים כמותיים נוצרים שניהם. הערה: כל נקודת נתונים מייצגת את הקרינה הגולמית עבור אותה החזר ROI עבור המסגרת הקשורה לאותה נקודת זמן נמדדת ספציפית.