מאמר שיטה

הדמיה פלואורסצנטית של דינמיקת סידן סינפטית במודל חוץ גופי של טרשת אמיוטרופית לרוחב

17 ביוני 2025

במאמר זה

תקציר

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מקור: Krishnamurthy, K. et al. מדידה פלואורסצנטית בזמן אמת של פונקציות סינפטיות במודלים של טרשת אמיוטרופית צידית. J. Vis. Exp. (2021)

סרטון זה מדגים הדמיית סידן בזמן אמת כדי לנטר פעילות סינפטית בתאי עצב מוטנטיים של ALS המבטאים חיישן ביולוגי של סידן מקודד גנטית. הוא מתאר את השלבים להכנת הנוירונים להדמיה, גירוי דינמיקת סידן והקלטת פלואורסצנטיות כדי למדוד שינויים בזמן אמת ברמות הסידן התוך-תאי, המשקפות פעילות סינפטית עצבית.

פרוטוקול

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. הדמיה פלואורסצנטית של מעברי סידן Gcamp6m

  1. Transfect נוירונים ראשוניים בקליפת המוח של מכרסמים שגודלו על צלחות תחתית זכוכית 35 מ"מ עם 500 ננוגרם של Gcamp6m.
    הערה: אם תרצה, טרנספקט משותף נוירונים עם פלסמיד מעניין המכיל תג פלואורסצנטי בטווח האדום או האדום הרחוק.
  2. דגרו על תאי עצב עם נוזל מוחי מלאכותי (aCSF) עם אשלגן כלורי נמוך (KCl) (טבלה 1) למשך 15 דקות, 48 שעות לאחר הטרנספקציה, ואז הרכיבו את הצלחת על פלטפורמת ההדמיה.
  3. דמיין את הקרינה GCaMP6m באמצעות מסנן פלואורסצאין איזותיוציאנט (FITC) (488 ננומטר) ומטרה של 20x או 40x.
  4. בחר את שדה ההדמיה והפעל מיקוד מושלם. לאחר מכן, צלמו תמונת סטילס אחת עם ערוצי סמן שדה בהיר, FITC ופלואאורסצנטי כדי לסמן גבולות עצביים.
  5. התחל הפעל עכשיו בתוכנת הרכישה. בצע את ההקלטה הבסיסית למשך 5 דקות ולאחר מכן השתמש ב-aCSF המכיל 50 מ"מ KCL (טבלה 1).
    הערה: מטרת הדמיה זו היא למדוד מעברי סידן מעוררים. אם לנוירון יש פעילות ירי בסיסית ושטפי סידן במהלך התקופה שלפני הגירוי, הוא אינו משמש בניתוח נתונים. במקום זאת, משתמשים רק בתאים עם פלואורסצנטיות רקע יציבה. ניתן גם להאריך את התקופות שלאחר הגירוי ל-60 דקות עבור מעברי סידן, עם או בלי זלוף רציף נוסף של KCl.
  6. שמור את הניסוי ונתח נתונים באמצעות תוכנה קונפוקלית. ניתן להפסיק את הניסוי בשלב זה, וניתן לבצע את הניתוח מאוחר יותר.
    הערה: אם התאים אינם דורשים טרנספקציה לביטוי חלבונים מעניינים, ניתן לבצע פרוטוקול זה בכל נקודת זמן במבחנה כאשר מבקשים לבחון מעברי סידן. לאחר בדיקה של תאי בקרה כדי להבטיח מדידת מעברי סידן, יש לעוור את הנסיין לתנאים הגנטיים או הפרמקולוגיים של כל מנה שנבדקה כדי למזער הטיה.

2. ניתוח תמונות

  1. פתח תמונות זמן-lapse עם תוכנה קונפוקלית.
  2. יישור תמונות בסדרות דולג זמן לפי סדרת הפקודות: תמונה | עיבוד | ישר את המסמך הנוכחי. בחר Align to the First Frame.
  3. בחר אזורי עניין (ROI) לאורך נויריטים באמצעות כלי בחירת ה-ROI, סמל בצורת שעועית בצד ימין של מסגרת התמונה. כמו כן, סמן החזר ROI המייצג את עוצמת הקרינה ברקע.
    הערה: החזר ROI נבחר על ידי בחירת אזורים של פונקטה מופרדת באופן מובהק לאורך מסלולים עצביים המצוינים על ידי תמונת הסטילס של השדה הבהיר. לפחות חמישה החזר ROI לכל נוירון נבחרים לניתוח. החזר ה-ROI של הרקע נבחר באזור של שדה הראייה שאינו מכיל נויריטים.
  4. מדוד פלואורסצנטיות גולמית לאורך זמן עבור החזר ROI נבחר באמצעות סדרת הפקודות הבאה: מדידה | מדידת זמן.
    1. הפעל את הפונקציה Measure בחלק העליון של החלונית Time Measurement. ייצוג גרפי של הקרינה הגולמית לאורך זמן ונתונים כמותיים נוצרים שניהם.
      הערה: כל נקודת נתונים מייצגת את הקרינה הגולמית עבור אותה החזר ROI עבור המסגרת הקשורה לאותה נקודת זמן נמדדת ספציפית.
  5. ייצא עוצמות פלואורסצנטיות גולמיות לתוכנת הגיליון האלקטרוני.

טבלה 1: הרכב חוצצי נוזל מוחי מלאכותי (aCSF).

מאגר נמוך של KCL aCSF (pH 7.40 עד 7.45)
ריכוזריאגנטים
HEPES10 מ"מ
NaCl140 מ"מ
KCl5 מ"מ
גלוקוז10 מ"מ
CaCl2 2H2O2 mM
MgCl2 4H2O1 mM
מאגר גבוה KCL aCSF (pH 7.40 עד 7.45)
ריכוזריאגנטים
HEPES10 מ"מ
NaCl95 מ"מ
KCl50 מ"מ
גלוקוז10 מ"מ
CaCl2 2 שעות2או2 מ"מ
MgCl2 4 שעות2או1 מ"מ

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
20x air objectiveNikon להדמיה
40x שמן טבילה יעדניקון להדמיה
B27 תוסףThermo Scientific17504044תוסף צמיחה עצבית
מזרקי BD ללא מחט, 50 מ"לThermo Scientific13-689-8חלק ממכלול זלוף הכבידה
מכסה מנוע תרבית תאים בטיחות ביולוגית BakerSterilGARD III SG403Aתרבית תאים אספטיים, טרנספקציה וטעינת צבע
בטא-מרקפטואתנולMillipore SigmaM3148לתרבות ותחזוקה של תרביות עצביות
סרום בקר אלבומיןMillipore SigmaA9418להכנת תרביות עצביות
סידן כלוריד דיהידראטMillipore Sigma223506רכיב של תמיסות aCSF
חממת פחמן דו חמצני תרבית תאיםThermo Scientific13-998-123לתרבות ותחזוקה של נוירונים
מיקרוסקופ קונפוקליNikonEclipse Ti +A1Rליבת להדמיה פלואורסצנטית מצלמת
CoolSNAP ES2 CCDפוטומטריה לרכישת תמונה
D-GlucoseMillipore SigmaG8270רכיב של פתרונות aCSF
קוביית מסנן FITCNikon77032509להדמיה מעברי סידן Gcamp
צלחות פטרי תחתונות זכוכית (עובי #1.5)CellVisD35-10-1.5-Nלצמיחת נוירונים על צלחת תרבית תואמת הדמיה
HEPESMillipore SigmaH3375מרכיב של תמיסות aCSF
נוזל מוחי מלאכותי גבוה KCl (aCSF) להדמיה.
סרום סוסיםMillipore SigmaH1138לתרבית ותחזוקה של נוירונים
LamininThermo Scientific23017015להכנת תרביות עצביות
L-15 Medium Thermo Scientific של לייבוביץ11415064להכנת תרביות עצביות
L-15 Medium של לייבוביץ, ללא פנול אדוםThermo Scientific21083027להכנת נוירונים תרביות
L-גלוטמין (200 מ"מ)Thermo Scientific25030149תוסף תרבית עצבית
Lipofectamine 2000 Transfection ReagentThermo Scientific11668019לטרנספיקציות עצביות
נמוך KCl נוזל מוחי מלאכותי (aCSF) להדמיה.
מגנזיום כלורידMillipore Sigma 208337רכיב של פתרונות aCSF
Microsoft ExcelMicrosoft תוכנה לניתוח / נורמליזציה של נתונים
יחידות סינון Nalgene, 0.2 מיקרומטר PESThermo Scientific565-0020יחידת סינון לתמיסת aCSF
מדיום נוירובזאליThermo Scientific21103049לתרבית ותחזוקה של תרביות עצביות
NIS-Elements מחקר מתקדםתוכנת ניקון ללכידת וניתוח תמונות
Nunc 15 מ"ל צינורות חרוטייםThermo Scientific339650להכנת תרבית עצבית ותמיסות חיץ
Nunc 50 מ"ל צינורות חרוטייםThermo Scientific339652להכנת תרבית עצבית ופתרונות חיץ
OptiprepMillipore SigmaD1556להכנת תרביות עצביות
PapainMillipore SigmaP4762להכנת תרביות עצביות
פניצילין-סטרפטומיצין (10,000 U/mL)Thermo Scientific15140122למניעת זיהום חיידקי של תרביות עצביות
זלוףWarner InstrumentsSF-77Bלהחלפת
צינורותזלוף aCSFCole-ParmerUX-30526-14חלק ממכלול זלוף הכבידה
pGP-CMV-Gcamp6m פלסמידAddgene40754להדמיית מעברי סידן
פולי-D-ליזין הידרוברומידMillipore SigmaP7886חומר ציפוי לצלחות פטרי תחתית זכוכית
אשלגן כלוריMillipore SigmaP3911רכיב של תמיסות aCSF
נתרן ביקרבונטMillipore SigmaS5761רכיב של תמיסות aCSF
נתרן כלוריMillipore SigmaS9888רכיב של פתרונות aCSF
שלב עליון חממהTokai Hit לדגירה של נוירונים חיים במהלך תקופת ההדמיה
TRITC קוביית מסנןNikon77032809להדמיה FM4-64
שולחן בידוד רטטיציאהחדשהVIP320X2430-135520שולחן/מעמד למיקרוסקופ
מערכת

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Synaptic Calcium DynamicsFluorescence ImagingAmyotrophic Lateral SclerosisGenetically Encoded Calcium BiosensorConfocal MicroscopyHigh Potassium ChlorideNeuronal Synaptic ActivityReal Time Calcium ImagingGCaMP6m FluorescenceVoltage Gated Calcium Channels

מאמרים קשורים