מיקרוסקופיה הולוגרפית דו-פוטונית לחקר פעילות עצבית וקישוריות במודל עכבר

תקציר

מקור: Kato, D. et. al., הערכה ומניפולציה של פעילות עצבית באמצעות מיקרוסקופיה הולוגרפית דו-פוטונית. J. Vis. Exp. (2022)

סרטון זה מדגים את טכניקת ההדמיה של שני פוטונים בשילוב עם אופטוגנטיקה באמצעות מיקרוסקופיה הולוגרפית. באמצעות מודולטור אור מרחבי, טכניקה זו מאפשרת גירוי עצבי מדויק המבטא את החלבון הרגיש לאור אדום והדמיית סידן עם נזק אור מינימלי. גישה זו מספקת תובנות לגבי הקישוריות והארגון התפקודי של רשתות עצביות.

פרוטוקול

כל ההליכים הכוללים מודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ומועצת הביקורת הווטרינרית של JoVE.

1. השתלת לוחית ראש (איור 1A)

1. יש לתת את חומר ההרדמה (תערובת של 74 מ"ג/ק"ג קטמין ו-10 מ"ג/ק"ג קסילזין) תוך צפקית כדי להרדים את העכבר. בדוק את מצב ההרדמה של העכבר לעתים קרובות על ידי הערכת רפלקסים הדוושה.
2. לאחר ההרדמה, הנח את העכבר במכשיר סטריאוטקסי. מרחו משחת עיניים (ראו טבלת חומרים) כדי למנוע מהקרנית להתייבש בעת השתלת לוחית הראש.
3. גלחו את אזור הניתוח וחטאו את העור בשלושה סבבים לסירוגין של קרצוף פובידון-יוד או כלורהקסידין ואחריהם מגבוני אלכוהול 70%. חשפו בזהירות את הגולגולת ונקו אותה בעזרת צמר גפן.
   הערה: יש לעקר את כל המכשירים הכירורגיים, ולבצע את כל ההליכים בהתאם. כל פסולת שנותרה (למשל, שיער או דם יבש) גורמת לתגובות דלקתיות. לכן, יש להסיר כל פסולת תחת סטריאוסקופ באמצעות צמר גפן רטוב במים סטריליים או 70% אלכוהול.
4. השתמש בקואורדינטות הסטריאוטקטיות - קדמית ואחורית = 0.5 מ"מ, מדיאלית ורוחבית = 1.5 מ"מ מברגמה - כדי למצוא את מרכז הגולגולת ולתייג אותו בעט טוש.
5. הניחו לוחית ראש בהתאמה אישית במרכז הגולגולת. לאחר מכן, מרחו מלט דנטלי (ראו טבלת חומרים) כדי לקבע אותו היטב לגולגולת. הפעל לחץ קל עד שלוחית הראש יוצרת מגע יציב עם החלק הקדמי והאחורי של הגולגולת.
   הערה: שלב זה אורך כ-20 דקות והוא קריטי להפחתת חפצי תנועה במוח במהלך הדמיה של שני פוטונים. מידות לוחית הראש הן 20 מ"מ × 40 מ"מ × 1 מ"מ עם פתח בצורת צלחת ביתית עם קצה אחד באורך 15 מ"מ, שני צדדים סמוכים באורך 3 מ"מ ושני הצדדים הנותרים באורך 10 מ"מ.
6. מערבבים יחד צמנט שרף דבק דנטלי על בסיס אקרילי באופן הבא: חצי כף אבקה, שלוש טיפות נוזל וטיפה אחת של זרז (ראה טבלת חומרים). כדי למנוע ייבוש, מרחו מלט שרף דבק דנטלי מעורב זה על משטח הגולגולת השלם של העכבר עם לוחית הראש.
7. הנח את העכבר בכלוב חם עד שיתאושש מההרדמה. אל תשאיר את העכבר ללא השגחה עד שהוא חזר להכרה מספקת כדי לשמור על שכיבה עצם החזה.

2. ניתוח והזרקת וירוס הקשור לאדנו-(AAV) (איור 1B)

1. בצע קרניוטומיה או הזרקה ויראלית ללא הסרת צמנט שרף הדבק הדנטלי מהגולגולת יום אחד לאחר השתלת לוחית הראש.
   הערה: יש לתת הרדמה (תערובת של 74 מ"ג/ק"ג קטמין ו-10 מ"ג/ק"ג קסילזין) תוך צפקית לעכבר במהלך הליך זה.
2. כדי למנוע בצקת מוחית, יש לתת דקסמתזון נתרן פוספט (1.32 מ"ג/ק"ג) תוך צפקי שעה אחת לפני הניתוח.
3. להרדים את העכבר עם לוחית הראש עם הרדמה איזופלורן 1% באמצעות וופורייזר (מערכת אספקת הרדמה) תוך שמירה על טמפרטורת הגוף עם כרית חימום. יש למרוח משחת עיניים למניעת ייבוש הקרנית.
4. תחת סטריאוסקופ, בצע קרניוטומיה מעגלית בקוטר של כ-2 מ"מ באמצעות מקדחה דנטלית. כדי להפחית את הנזק המוחי, הפעל את המקדחה הדנטלית בזהירות בתנועה קלה מתמדת ולחץ קל כלפי מטה.
5. הסר שברי עצם מספר פעמים באמצעות מערכת יניקה. לאחר הסרת שברי העצם, השתמש בתמיסת נוזל עמוד שדרה מלאכותי (ACSF) כדי להסיר ולשטוף את כל הפסולת שנותרה על פני המוח. חזור על הליך ניקוי זה מספר פעמים כדי לדכא תגובות דלקתיות.
   הערה: תמיסת ACSF (140 מ"מ נתרן כלורי, NaCl, 2.5 מ"מ אשלגן כלורי, KCl, 5 מ"מ 4-(2-הידרוקסיאתיל)-1-פיפראזין-סולפונית, HEPES, 2.0 מ"מ סידן כלורי, CaCl₂, ו-1.0 מ"מ מגנזיום כלוריד, MgCl₂) אוחסנה ב-4 מעלות צלזיוס למשך חודש אחד לאחר המסת המגיב וסינון (גודל נקבוביות = 0.22 מיקרומטר).
6. באמצעות מערכת הזרקת לחץ (ראה טבלת חומרים), הגדר את הלחץ המתאים (כ-10 פאונד לאינץ' רבוע (PSI) בפולסים עם משך של 4 אלפיות השנייה) כדי להזריק 500 נ"ל של תמיסת AAV דרך נימי זכוכית בקוטר קצה של 10-20 מיקרומטר (מוכן עם מושך מיקרופיפטה) למשך 10 דקות.
7. קבע אם תמיסת ה-AAV ניתנת למוח על ידי בדיקה האם רמת תמיסת ה- AAV בנימי הזכוכית יורדת בהדרגה.
8. השאר את נימי הזכוכית במקומו למשך 10 דקות נוספות כדי למנוע זרימה חוזרת. חזור על הפעולה שלוש פעמים כדי לתת בסך הכל 1.5 מיקרוליטר של תמיסת AAV למוח.
9. כדי להעריך ולתפעל את הפעילות העצבית בתאים פירמידליים בשכבה 2/3 (L2/3), יש להזריק תמיסת AAV (להדמיית Ca²⁺: AAV2/1-Syn-jGCaMP8f-WPRE ב-1.28 × 10¹⁴ גנומים וקטוריים/מ"ל, מדולל 1:1 במי מלח; להדמיית Ca²⁺ עם אופטוגנטיקה: AAV2/8-CaMKII-GCaMP6m-P2A-ChRmine-Kv2.1-WPRE ב-1.73 × 10¹⁴ גנום וקטורי/מ"ל, מדולל 1:1 במי מלח) לאזור הכפה האחורית של קליפת המוח הסומטוסנסורית הראשונית של עכברים מסוג בר (S1, מרוכז ב-0.5 מ"מ אחורי ו-1.5 מ"מ לרוחב מהברגמה, עומק של 150 מיקרומטר מפני השטח).
   הערה: יש להזריק את תמיסת ה-AAV לאחר 2-3 שבועות ו-1-2 שבועות לפני ההדמיה לביטוי jGCaMP8f ו-GCaMP6m-P2A-ChRmine, בהתאמה.
10. לאחר מריחה של 2% (w/v) אגרוז נמס נמוך על פני המוח של S1 באמצעות מיקרופיפטה, הניחו חלון זכוכית מעל הגולגולת עם שתי משקפי כיסוי. חבר את שתי כוסות הכיסוי (קוטר קטן של 2.0 מ"מ וקוטר גדול של 4.5 מ"מ; ראה טבלת חומרים) עם דבק אולטרה סגול (UV) הניתן לריפוי.
11. לחץ את זכוכית הכיסוי על האגרוז כשהוא עדיין נוזלי; זה מונע היווצרות בועות אוויר באגרוז. אטמו את שולי חלון הגולגולת עם מלט שרף דנטלי ודביק (איור 1C).
12. הסר את העכבר מהמכשיר הסטריאוטקסי והחזיר אותו לכלוב שלו. הניחו את העכבר בכלוב חם ואל תחזרו לכלוב עם בעלי חיים אחרים עד שהוא התאושש לחלוטין מההרדמה. שמור בזהירות על תנאים סטריליים במהלך ניתוח הישרדות.
13. במשך 72 השעות הראשונות לאחר הניתוח, בדוק את מצב הבריאות של העכבר על ידי התבוננות בהתנהגות כללית. אם יש חריגות כלשהן בהתנהגות הכללית, יש להזריק תת עורית חומרים נוגדי דלקת ומשככי כאבים.

3. הכנה למערכת הגירוי או ההארה ההולוגרפית (איור 2)

1. כייל את מערכת הגירוי ההולוגרפי על ידי הצבת פני השטח של שקופית פלואורסצנטית אדומה (מצע אקרילי יצוק) במישור הדגימה. הנח את המיקרוסקופ במצב הדמיה חיה עם אור עירור חלש והפעל את calibration_GUI.m file. בדוק את חלונית הפרמטרים ולחץ על כפתור שמור .
2. לחץ על לחצן Z סריקה בחלונית שלב 1. זה ייצור אוטומטית שלושה כתמים אקראיים בכל 21 המישורים הציריים, במרחק של 2 מיקרומטר זה מזה מכל מישור.
3. הזז את פס ההחלקה ובדוק את התמונה החיה. מצא מישור מושלם שבו הכתמים נראים הקטנים והבהירים ביותר, ולאחר מכן לחץ על לחצן שמור . זה ייצור אוטומטית חזית גל כדורית אופסט עבור ההולוגרמה הדיגיטלית.
   הערה: אם אינך מצליח למצוא את נקודות הקרינה הבהירות ביותר, שנה את ערכי המינימום והמקסימום של טווח הסריקה ונסה שוב.
4. לחץ על לחצן עבור בחלונית שלב 2 ולאחר מכן לחץ על שישה מקומות בריבוע הימני. בדוק את התמונה החיה. אם יש שש נקודות פלואורסצנטיות שניתן להבחין בהן, הקלד את ציר ה-x וה-y שלהן בתיבות העריכה ולחץ על כפתור שמור . זה ייצור אוטומטית מקדמי טרנספורמציה אפיניים כדי לתאם כיול בין מערכת הגירוי ההולוגרפי וההדמיה.
   הערה: יש להתאים את מספר זוג הצירים ומספר הנקודה שנלחצת לפי הסדר. אם אינך בטוח, או אם אין כתמים בתמונה שלך, נסה שוב וצור דפוס נקודה ייחודי או בחר טווח קטן יותר סביב מרכז שדה הראייה (FOV).
5. לחץ על לחצן סרוק בחלונית שלב 3. הוא יפיק 441 הולוגרמות דיגיטליות לביצוע סריקה נקודתית בודדת על פני ה-FOV ב-21 ×-21 שלבים.
   1. ראשית, בדוק את התמונות בעת שינוי דפוסים בתיבת הרשימה. לאחר מכן, כוונן את עוצמת הלייזר כדי לקבל תמונות נקודתיות בטווח הדינמי של מכשיר ההדמיה (למשל, כדי למנוע תמונות רוויות מדי).
   2. לאחר מכן, התאם את זמן המרווח בתיבת העריכה; זמן מרווח הזמן צריך להיות יותר מפי שניים מזמן מרווח ההקלטה. לבסוף, הכנס את התקן ההדמיה למצב הקלטה ולחץ על כפתור הפעל . אם ההפעלה מסתיימת, יוצגו מחרוזות "הצג אישור" בחלון הפקודה. הפסק את ההקלטה וערום תמונות רציפות מוקלטות בשיטת העוצמה המרבית.
6. לחץ על Generate WM בחלונית שלב 4 ובחר תמונה מוערמת מלמעלה. לאחר מכן סגור את חלון calibration_GUI. זה ייצור אוטומטית מפת משקל כדי לפצות על העוצמה הלא מאוזנת בכל נקודה.
   הערה: לתיאור מפורט יותר, ניתן להוריד את קוד MATLAB מכאן (https://github.com/ZenKG/SLM_control).

4. Ca²⁺ הדמיה באמצעות חיישן תמונה עם תאורה הולוגרפית (איור 3)

1. הנח את העכבר המוזרק על ידי AAV עם לוחית ראש מתחת למיקרוסקופ ( איור 1D).
   הערה: במהלך הליך זה, העכבר מרוסן במצב ערות, אך מסוגל לברוח מגירויים לא נוחים.
2. בצע הדמיה של שני פוטונים (מצב סריקת נקודה) באמצעות מיקרוסקופ הולוגרפי ולייזר Ti נעול מצב: ספיר מכוון ל-920 ננומטר עם מטרה של פי 25 (ראה טבלת חומרים).
3. הפעל את תוכנת ההדמיה המסחרית (ראה טבלת חומרים). במצב הדמיה חיה, כוונן את המתח של גלאי התמונה (ראה טבלת חומרים) ואת כוחו של לייזר ההדמיה כדי לייעל את בהירות הנוירונים המבטאים jGCaMP8f. צלם תמונות של הנוירונים המבטאים חלבון זה.
   הערה: עוצמת לייזר ההדמיה (920 ננומטר) היא 20-30 mW. ה-FOV היה 512 מיקרומטר ×-512 מיקרומטר בעומק של 100-150 מיקרומטר מפני השטח של קליפת המוח.
4. כדי להאיר נוירונים ספציפיים המבטאים jGCaMP8f עם תאורה הולוגרפית, הפעל את קובץ הסקריפט SLMcontrol.m. לחץ על תמונת הפניה ובחר את התמונה שנרכשה למעלה. לאחר מכן, לחצו על כפתור Spot כדי לבחור פיקסלים מסוימים בתאי העצב בתמונה על ידי לחיצה מתמשכת על העכבר (איור 3A). אם הבחירה הושלמה, לחץ על כפתור Enter במקלדת כדי לסיים אותה.
   הערה: ההולוגרמה הדיגיטלית מחושבת אוטומטית ומוצגת על גבי מאפנן האור המרחבי (SLM). ניתן לחזור על דפוס זה גם על ידי לחיצה על תיבת רשימה. הרזולוציה המרחבית של נקודה בודדת שנוצרה על ידי ה-SLM הייתה כ-1.2 מיקרומטר לאורך הכיוון הרוחבי ו~8.3 מיקרומטר לאורך הציר האופטי. השתמשנו בעדשה אובייקטיבית עם צמצם מספרי גבוה (1.1) כדי להשיג גירוי הולוגרפי מקומי יותר.
5. כדי לזהות פעילות עצבית ברזולוציה זמנית גבוהה באמצעות חיישן תמונה (ראה טבלת חומרים), הגדר את זמן החשיפה, אזור ההדמיה והשילוב ( איור 3B) לפני ביצוע רכישת תמונה ( איור 3C).
   הערה: עוצמת לייזר הארה הולוגרפי (920 ננומטר) המגרה באופן רציף תא עצב אחד היא 2 mW, וזה מספיק כדי לזהות פעילות עצבית. לדוגמה, כדי להשיג קצב פריימים של 100 הרץ להדמיה, זמן החשיפה הוא 9 אלפיות השנייה, שטח ההדמיה הוא 400 מיקרומטר × 400 מיקרומטר והשילוב הוא 4.
6. לאחר הניסוי, החזירו את העכבר לכלוב הביתי שלו.

5. הדמיה דו-פוטונית (מצב סריקה נקודתית) עם אופטוגנטיקה באמצעות מיקרוסקופ הולוגרפי (איור 4)

1. חזור על שלבים 4.1 ו-4.2.
2. הפעל את תוכנת ההדמיה המסחרית (ראה טבלת חומרים). במצב הדמיה חיה, כוונן את המתח של גלאי התמונה (ראה טבלת חומרים) ואת כוחו של לייזר ההדמיה כדי לייעל את בהירות הנוירונים המבטאים GCaMP6m-P2A-ChRmine. צלמו תמונות של תאי העצב שמבטאים את החלבונים האלה ( איור 1E).
3. חזור על שלב 4.4.
4. כדי לחקור את הקישוריות התפקודית בתוך נוירונים L2/3, השתמש ב-SLM כדי ליצור דפוסים הולוגרפיים של גירוי אופטוגנטי (ChRmine; 1,040 ננומטר) ולשלב אותו עם הדמיית Ca²⁺ (GCaMP6m; 920 ננומטר, 512 × 512 פיקסלים, 2 הרץ או 30 הרץ, זום דיגיטלי פי 2, מצב סריקת נקודות; איור 3D-H).
   1. עבור פרוטוקול זה, הגדר את עוצמת לייזר ההדמיה ל-920 ננומטר, ב-10-20 mW, ואת ה-FOV כ-256 מיקרומטר ×-256 מיקרומטר הנמדד בעומק של 100-150 מיקרומטר מהמשטח בקליפת המוח. הגדר את זמן השהייה של הפיקסלים ל-1.5 מיקרון עבור 2 הרץ או 100 ns עבור 30 הרץ.
   2. כדי לראות אם גירוי הולוגרפי יחיד גרם לתגובת סידן בתאי העצב, השתמש גם ב-2 הרץ וגם ב-30 הרץ כקצב הפריימים של ההדמיה. הגדר את עוצמת הלייזר לגירוי הולוגרפי (1,040 ננומטר) שמגרה תא עצב בודד ב-10 mW, וזה מספיק כדי לגרום לפעילות עצבית (איור 3D).
      הערה: הרזולוציה המרחבית של נקודה בודדת שנוצרת על ידי ה-SLM היא כ-1.2 מיקרומטר לאורך הכיוון הרוחבי ו~8.3 מיקרומטר לאורך הציר האופטי. טווח הנפח הנגיש בכיוון הרוחבי הוא בסביבות 500 מיקרומטר × 500 מיקרומטר ו-100 מיקרומטר בכיוון הצירי. אישרנו עוד עם הדמיית Ca²⁺ בקצב פריימים של הדמיה של 2 הרץ או 30 הרץ שלא רק נוירון אחד, אלא מספר נוירונים יכולים להיות מגורים הולוגרפית בו-זמנית (איור 3E).
5. בצע רכישת תמונה עם הפרוטוקול הבא: דמיין בו-זמנית את תגובת Ca²⁺ ב-920 ננומטר עם 10 גירויים הולוגרפיים ב-1,040 ננומטר במרווחים של 8 שניות (0.125 הרץ) למשך 50 אלפיות השנייה לאחר תקופת בסיס של 10 שניות.

תוצאות

איור 1: מתאר סכמטי של הליך הניסוי. (A) קיבוע לוחית הראש לגולגולת. (B) הזרקה סטריאוטקטית של AAV לאזור הכף האחורית של קליפת המוח הסומטוסנסורית הראשונית (S1HL). (C) השתלת חלון הגולגולת. כדי להעריך ולתפעל א...

חומרים