הדמיית סידן בזמן אמת של קליפת המוח הקדם-מצחית האמצעית של עכבר באמצעות מיניסקופ

תקציר

מקור: Thapa, R., et. al., הזרקה ויראלית סטריאוטקסית והשתלת עדשות אינדקס שיפוע למוח עמוק In Vivo הדמיית סידן. J. Vis. Exp. (2021)

הסרטון מדגים הדמיית סידן בזמן אמת באמצעות מיניסקופ בעכבר שעבר התמרה, ומתאם בין פעילות עצבית להתנהגות.

פרוטוקול

הרכבה של מיניסקופ ו- in vivo} Ca²⁺ הדמיה (איור 1)

1. הרכיבו את המיניסקופ לבסיסו
   1. הרדימו את העכבר לזמן קצר בתא האינדוקציה (5% איזופלורן וקצב זרימת חמצן של 1 ליטר לדקה). הנח את העכבר על משטח ספסל נקי.
   2. שחרר את בורג הנעילה בעזרת מברג קטן, הסר את מכסה המגן ונקה את פני השטח של עדשת GRIN (עדשת אינדקס שיפוע) בעזרת צמר גפן ספוג אצטון.
   3. עטפו סרט PTFE (סרט פוליטטרפלואורואתילן) בחוזקה סביב חוט המיניסקופ והדקו את המיניסקופ לבסיסו על ראש העכבר.
   4. חבר את המיניסקופ לכבל (איור 2K), והפעל את תוכנת NeuView.
   5. ב-NeuView, לחץ על Hardware, סמן את LED1, ולחץ על כפתור Stream כדי להציג את התמונות החיות (איור 3A).
   6. זהה את מישור המוקד הטוב ביותר על ידי התאמת מיקום המיניסקופ ביחס לבסיס, הידוק קל או התרופפות בעזרת מלקחיים קהים.
      הערה: מישור המוקד הטוב ביותר נקבע על ידי השוואה בין מספר מיקומים אפשריים ובחירת זה עם הדמיה ברורה של רוב גופי התאים.
   7. הדק את בורג הנעילה והנח את העכבר בחזרה בכלוב הביתי שלו.
   8. ב-NeuView, כוונן את עוצמת תאורת ה-LED לרמה האופטימלית. לחץ על לכוד ולאחר מכן על הפעל את כדי להתחיל להקליט ולחץ על עצור לאחר 150 פריימים.
      הערה: ההספק הנמוך ביותר האפשרי קובע את הרמה האופטימלית של עוצמת ה-LED להשגת תמונה בהירה מספיק. מטרת הקלטת סרטון קצר היא להקל על זיהוי אותו מישור מוקד בעתיד להדמיה חוזרת.
   9. נתק את הכבל מהמיניסקופ. תן לעכבר להתאושש לפחות 30 דקות לפני תחילת הניסוי.
      הערה: כדי להגן על המינסקופ, בדרך כלל, בקבוק המים ומזין המזון החוטי מוסרים במהלך פרק זמן קצר זה. אם העכבר צריך להישאר בכלוב הביתי שלו זמן רב יותר, מומלץ לספק ג'ל דיאט זמין מסחרית (ראה טבלת חומרים) בכלוב הביתי.
2. רכישת נתונים עבור in vivo הדמיית סידן
   הערה: In vivo, הדמיית סידן יכולה להתבצע בו זמנית יחד עם כל מבחני התנהגות שהחוקר רוצה. למטרות הדגמה, הדוגמה כאן היא in vivo Ca²⁺ הדמיה במהלך בדיקת שדה פתוח. כדי להשיג מטרה זו, נדרשים שני מחשבים. מחשב אחד מצויד בתוכנה מסחרית (ראו טבלת חומרים) כדי לשלוט במצלמה כדי לתעד את התנהגות העכבר באופן אוטומטי. המחשב השני מצויד ב-NeuView כדי לשלוט במיניסקופ ולהקליט את תמונות Ca²⁺.
   1. הפעל את תוכנת מצלמת ההתנהגות (ראה טבלת חומרים) כדי להציג את זירת התנהגות העכבר באמצעות פונקציית שידור חי. כוונן ידנית את המיקוד של המצלמה העליונה (איור 2L).
   2. בחר Trigger/Strobe וסמן "Enable/disable trigger" ( איור 3B). לחץ על כפתור הקלט , השתמש ב- עיין ב- כדי לבחור את המיקום שבו יישמרו הקלטות התנהגות, ובחר את פורמט התמונה הרצוי.
      הערה: הפונקציה "בקרת טריגר" מופעלת כדי לאפשר את הפעלת הקלטת ההתנהגות על ידי תוכנת NeuView כך שמסגרות ההתנהגות ומסגרות הדמיית הסידן המתאימות מחוברות יחד באופן זמני. ניתן לשמור את הקלטת ההתנהגות בכל פורמט רצוי. הקלטת התנהגות נשמרת בדרך כלל בתבנית JPEG בתיקייה המיועדת.
   3. קרבו את העכבר לזירה וחברו את המיניסקופ לכבל המקושר למערכת רכישת הנתונים ( איור 2L) (ראו טבלת חומרים). לאחר מכן העכבר ממוקם במרכז הזירה.
   4. עם פונקציית הזרם החי של תוכנת NeuView, כוונן את עוצמת ה-LED כדי לייעל את הבהירות של תמונת הסידן.
      הערה: עבור הדמיית סידן, קצב הפריימים של ההקלטה הוא 10 פריימים לשנייה כברירת מחדל.
   5. ב-NeuView, בטל את הסימון של LED1, לחץ על Capture, ולאחר מכן על הפעל את כפתורי כדי להתחיל להקליט, ולחץ על עצור לאחר 100 פריימים.
      הערה: זה נועד להקליט תמונות רקע של כ-100 פריימים עם נורות LED כבויות.
   6. בתוכנת מצלמת ההתנהגות, לחץ על התחל הקלטה ( איור 3C). ב-NeuView, סמנו את LED1, לחצו על Capture, ואז על כפתורי הפעילו כדי להתחיל בהקלטה. לחץ על עצור לאחר 3000 פריימים.
      הערה: זה נועד לתעד הדמיה והתנהגות של סידן בו זמנית. מבחן השדה הפתוח הוא באורך 15 דקות, המחולק בדרך כלל לשלושה מפגשי הקלטה של 5 דקות כל אחד. זאת כדי למנוע התחממות יתר של המיניסקופ עקב שימוש מתמשך.
   7. שמור הן את הדמיית הסידן והן את הקלטות ההתנהגות בתיקיות המיועדות לכך. חזור על ההקלטה לשני מפגשים נוספים תוך הקלטת הרקע לפני כל מפגש, ושמור את כל ההקלטות בתיקייה המיועדת.

תוצאות

איור 1: סקירה סכמטית של הליך הניסוי. (A) הזרקה סטריאוטקסית של הנגיף בקליפת המוח הקדם-מצחית (קליפת המוח הקדם-מצחית האמצעית). (B) השתלת עדשת GRIN (עדשת אינדקס שיפוע) ב-mPFC. (C) הצמדת בסיס המינ...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
Acetone	Sigma-Aldrich	179124-1L	GRIN
lens cleaner תוכנה לקידוד התנהגות (Point Grey FlyCap2)	Point Grey	Point Grey Grey מחקר Blackfly BFLY-PGE-12A2C	להתנהגות הקלטה
רכישת נתונים בקר	NIDA/IRP	בעיצוב מותאם אישית	של מערכת רכישת תמונה
כבל העברת נתונים	NIDA/IRP	בעיצוב מותאם אישית	של מערכת רכישת תמונה
עדשת GRIN GRINTECH		NEM-100-25-10-860-S	להשתלת עדשת GRIN
בסיס מיניסקופ	Protolabs	תוכנן בהתאמה אישית	להרכבת הבסיס
Miniscope זרוע אחיזה	NIDA/IRP	מעוצב בהתאמה אישית	להרכבת מכסה ההגנה הבסיסי
Miniscope	Protolabs	תוכנן בהתאמה אישית	להגנה על המיניסקופ
בקר ממונע	Thorlabs	KMTS50E	להרכבת הבסיס
NeuView	NIDA/IRP	https://github.com/giovannibarbera/miniscope_v1.0	להדמיה in vivo
משחת עיניים	Puralube Vet משחה NDC	17033-211-38
קלטת עיניים פוליטטרפלואורואתילן (PTFE) TegaSeal	PTFE קלטת	A-A-58092	לחיזוק miniScope לבסיס
ספוגית כותנה סטרילית	פוריטנית	REF 806-WC	לשני הניתוחים

רכיב רכיב של