$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
כל ההליכים הכוללים מודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ומועצת הביקורת הווטרינרית של JoVE.
1. הגדרת מיקרוסקופ להדמיית זמן-lapse
1. קביעת הגדרות לייזר
1. קביעת אורך גל לייזר לשימוש. השתמש באורך גל שהוא כפול מאורך גל העירור של הפלואורופור המעניין (למשל אורך גל בין 880 ל-940 ננומטר עבור חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP).
הערה: במחקר הנוכחי, הגדרת אורך הגל עבור GFP הייתה בין 880 ל-940 ננומטר. ככל שאורך הגל גבוה יותר, כך הספק המוצא של הלייזר נמוך יותר.
2. קבע שידור לייזר. אחוז גבוה של העברת לייזר יהרוג את העובר, השתמש ברמת ההעברה הנמוכה ביותר (מומלץ). עבור מחקרי זמן-lapse של 24 עד 48 שעות, כפי שמוצג כאן, שמור על העברה מתחת ל-5%.
3. קבע מערכות זיהוי מיקרוסקופ וודא שהמסננים הנכונים עבור הפלואורופור נמצאים במקומם.
הערה: עבור מיקרוסקופים מרובי פוטונים, ישנן מערכות גילוי מרובות עם רגישויות שונות לפלואורסצנטיות הנפלטת. באופן כללי, למערכת גילוי פנימית יש פחות רגישות מאשר למערכת גילוי חיצונית. עבור קווים טרנסגניים עם רמות גבוהות של ביטוי GFP, מערכת הזיהוי הפנימית מספקת. עבור קווים טרנסגניים עם רמות נמוכות של ביטוי GFP או עם פלואורופורים אחרים (למשל, חלבון פלואורסצנטי אדום), ייתכן שתידרש מערכת זיהוי חיצונית כדי לשמור על אחוז העברת הלייזר ברמה סבירה. ללא קשר למערכת הזיהוי המשמשת, המסננים הנכונים לפלואורופור חייבים להיות במקום.
2. התאמת הגדרות התוכנה במיקרוסקופ הרב-פוטוני
1. באמצעות המטרה 5X, אתר את העובר. הרם ידנית את הבמה למיקום הגבוה ביותר והשתמש במיקוד העדין כדי למקם את העובר באמצע טווח המיקרוסקופ.
2. הורד ידנית את הבמה ושנה את יעד הטבילה במים פי 25 (צמצם מספרי NA, 0.95). הרם בזהירות את הבמה כדי להחזיר את העובר לפוקוס.
3. בתוכנה, לחץ על מצב "xyzt" להשגת תמונות מרובות במרווחי זמן (t) במישור xy על פני עומק של "z". השתמש בתצוגת האפיפלואורסצנציה או השדה הבהיר כדי למצוא את עומק המיקוד באזור העניין, אשר יתחם את מחסנית ה-Z.
1. בתוכנה, לחץ על כפתור "התחל"; עבור ניסויים אלה, הקצה הצדדי של העין היה תחילתה של מחסנית Z. לחץ על כפתור "סיום"; קו האמצע של העובר היה קצה מחסנית Z.
הערה: גודל הצעד היה 0.3-0.6 מיקרומטר והיה בסך הכל ~200 צעדים לגודל מחסנית z של 60 עד 120 מיקרומטר).
4. לחץ על התפריט להתאמת זמן הרכישה ותדירות ההדמיה.
עבור המערכת הנוכחית, ~200 שלבים דורשים כ-5 דקות עבור כל רכישת z-stack. להתאוששות נאותה של הפלואורופור והישרדות העובר, אפשר יחס של לפחות 1:3 בין רכישת מחסנית z (הפעלת לייזר) לזמן ההתאוששות (כיבוי לייזר).
הערה: לדוגמה, ערימות z נרכשות כל 20 דקות עם 5 דקות של רכישת z-stack ו-15 דקות של התאוששות. עבור פרוטוקול זה, ניתן להשיג ערימות z גדולות יותר, אך יגדילו כראוי את הזמן בין רכישות z-stack, וכתוצאה מכך פחות תמונות לאורך מהלך ה-time-lapse.
1. עם הזמן המתאים לשחזור עוברים, הגדר את הזמן בין ערימות z בחלון המיועד. הגדר את משך הזמן הכולל עבור הניסוי בחלון המתאים.
5. התאמות סופיות של תוכנה, לייזר ועוברים.
1. הפעל את הגדרת התמונה החיה כדי לבצע התאמות אחרונות בהגדרות הלייזר. התאם את פסי המחוון של שידור לייזר, רווח והיסט בתוך התוכנה כדי לייעל את התמונה הפלואורסצנטית. כמו כן, התאם את כיוון העובר, לפי הצורך, בהתאם לאורך הניסוי, הצמיחה הצפויה של העובר וכו '. ודא שאזור העניין נשאר בתוך המסגרת לאורך כל הניסוי.
2. כבה את מקור האור האפיפלואורסצנטי מכיוון שהוא כבר לא נחוץ במהלך רכישת זמן-lapse. כסו את ה-stage עם קופסת הבטיחות בלייזר (איור 1I). בעת שימוש במערכת הזיהוי הפנימית, תיבת הבטיחות בלייזר מתאימה להגנה מפני אור רקע. לחץ על "start".
הערה: עם זאת, עם מערכות זיהוי חיצוניות רגישות יותר, תיבת הבטיחות בלייזר אינה חוסמת מספיק אור רקע, ונדרשים כיסויים נוספים כדי למנוע הפרעה ברכישת התמונה.
2. במהלך רכישת זמן-lapse
1. מלאו מחדש את תא האמבטיה הפתוח במדיה עוברית עם קיטועי זמן כל 8-12 שעות (לפחות פעמיים ביום) במהלך רכישת דולג זמן דרך דלתות ההזזה בקופסת הבטיחות בלייזר (איור 1I).
2. לפני פתיחת דלתות תיבת הבטיחות בלייזר, ודא שהמיקרוסקופ אינו רוכש תמונה באופן פעיל.
הערה: השימוש בתנורי חימום ובמערכות מדיה במחזור אינו הכרחי לניסויי הדמיה בזמן-lapse הנמשכים 24 עד 48 שעות. ואכן, קשה לשלוט בטמפרטורות של תנורי חימום בשלב ובשורה, ובמהלך רכישת התמונה העובר מפגין קצב התפתחות הולם בטווח טמפרטורות שבין 25-28 מעלות צלזיוס. יתר על כן, מערכות מדיה במחזור נוטות לעלות על גדותיהן ועלולות לפגוע בציוד. לפיכך, כל העוברים מבוימים באופן שגרתי לאחר הרכישה.
3. עיבוד לאחר הרכישה
1. בתוכנה, לחץ על תפריט "קובץ" ובחר "שמור".
2. פתח את הקובץ בתוכנת עיבוד תמונה (ראה טבלת החומרים). הדגש את סדרת התמונות הנכונה. בתוכנה, בחר בתפריט "תהליך". לחץ על 3D Deconvolution ו- "Apply" כדי לבטל את הפיתול של כל z-stack.
הערה: הקובץ גדול; לכן, שלב זה עשוי להימשך שעות רבות.
3. בתוכנה, תחת תפריט "תהליך", לחץ על "הקרנה מקסימלית". לחץ על "החל" כדי ליזום הקרנה מקסימלית ליצירת תמונה אחת לכל ערימת z. ייצא כל קובץ מוקרן מרבי (תמונה אחת לכל ערימת z) כ-tiff.
4. ייבא קבצי tiff בודדים לתוכנת עיבוד וידאו. בחר את כל קבצי ה-tiff וגרור אותם לעורך הווידאו. התאם את האורך של כל תמונה בסרטון ל-0.1 שניות. ייצא וידאו כקובץ mov או mp4.
