הדמיה של דפוסי הקרנה אקסונליים של נוירונים מוטוריים עובריים בדרוזופילה

Abstract

מקור: Jeong, S. הדמיה של דפוס ההקרנה האקסונלי של נוירונים מוטוריים עובריים ב-Drosophila. J. Vis. Exp. (2017)

סרטון זה מדגים את ההדמיה של הקרנות אקסונליות בעוברים Drosophila. תיוג חיסוני של נוירונים מוטוריים, דיסקציה מדויקת לחשיפת מבנים עצביים ומיקרוסקופ ניגודיות של הפרעות דיפרנציאליות חושפים ביחד ארכיטקטורה עצבית מפורטת, תוך שימת דגש על דפוסי ההקרנה האקסונלית.

Protocol

1. הכנה

1. הכן 500 מ"ל של תמיסת מלח עם חוצץ פוספט (PBS) עם תמיסת t-Octylphenoxypolyethoxyethanol (PBT) על ידי הוספת 0.5 גרם אלבומין בסרום בקר (BSA) ו-0.5 מ"ל של t-Octylphenoxypolyethoxyethanol (ראה טבלת החומרים) ל-500 מ"ל של 1X PBS וערבוב במשך 30 דקות לפחות. יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. יש להשתמש כשהוא טרי יחסית ולאחסן את התמיסה בבקבוק נקי.
2. הכינו 10 מ"ל של 4% פרפורמלדהיד על ידי הוספת 2.5 מ"ל של תמיסת פרפורמלדהיד 16% מלאי ו-1 מ"ל של 10x PBS ל-6.5 מ"ל מים נטולי יונים. יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס ולהשתמש תוך שבוע.
   זהירות: הימנע ממגע עור עם תמיסת פרפורמלדהיד מכיוון שהיא רעילה מאוד.
3. הכינו מצע 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-Gal) (10% w/v X-Gal בדימתיל סולפוקסיד (DMSO)) על ידי המסת 0.1 גרם של מצע X-Gal לכל 1 מ"ל של DMSO. יש לאחסן בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס ב-100 מיקרוליטר בכמויות גדולות.
4. הכינו תמיסת צביעה X-Gal באמצעות 10 מ"מ מאגר פוספט (pH 7.2), 150 מ"מ נתרן כלורי, NaCl, 1 מ"מ מגנזיום כלוריד, MgCl₂, 3 מ"מ אשלגן פרוציאניד, K₄[FeII(CN)₆], 3 מ"מ אשלגן פריציאניד, K₃[FeIII(CN)₆], ו-0.3% t-אוקטילפנוקסיפוליאתוקסיאתנול. יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס בחושך.
5. הכינו תמיסת מי חמצן 3% על ידי דילול 30% מי חמצן במלאי 1:10 במים נטולי יונים.
6. הכינו תמיסת 3,3′-diaminobenzidine (DAB) על ידי המסה מלאה של טבליה אחת (10 מ"ג) של DAB ב-35 מ"ל של תמיסת PBT טרייה. סנן דרך מסנן מזרק של 0.2 מיקרומטר ואחסן ב-20 מעלות צלזיוס ב-910 מיקרוליטר בכמויות.
   זהירות: השלך את כל פסולת ה-DAB באקונומיקה כדי להשמיד את ה-DAB.
7. הכינו צלחות ביצים עם מיץ תפוחים. הוסף 35 גרם אגר ו -1 ליטר מים נטולי יונים לבקבוק של 2 ליטר. הוסף 33 גרם סוכרוז, 2 גרם טגוספט ו -375 מ"ל מיץ תפוחים לבקבוק של 1 ליטר. ממיסים אותם על ידי חיטוי למשך 30 דקות. הניחו לשתי התמיסות להתקרר לסביבות 60 מעלות צלזיוס. ערבבו וערבבו היטב את התמיסות הללו על ידי ערבוב. יוצקים ~ 11 מ"ל מהתמיסה המשולבת לכל צלחת תרבות 60 מ"מ.
8. מכינים משחת שמרים על ידי מיזוג שמרי אופה במים נטולי יונים (יחס של 1:0.8) ושומרים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.

2. איסוף עוברים (יום 1)

1. אסוף זבובים צעירים נקבות וזכרים (מתחת לגיל 5 ימים), ובמשך 1-2 ימים, שמור אותם בכלוב כוסות פלסטיק עם צלחת ביצה (60 מ"מ על 15 מ"מ) המכילה כמות קטנה של רסק שמרים במרכז.
2. לאיסוף אופטימלי של עוברים בשלב מאוחר של 16, הקימו כלוב בקבוק עם זבובים (> 50) בסביבות השעה 17:00 ותנו להם להטיל ביצים בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס למשך 3 שעות.
3. העבירו את הזבובים לבקבוק מזון טרי.
4. סוגרים את צלחת הביצים עם המכסה ומדגרים אותה הפוכה ב-25 מעלות צלזיוס באינקובטור לח (~70% לחות) למשך הלילה.

3. הכנת עוברים לצביעה חיסונית (יום 2)

1. הוסף 1.8 מ"ל של תמיסת PBT לצלחת הביצים בסביבות השעה 10:20 בבוקר והשתמש בצמר גפן כדי לשחרר את העוברים מהצלחת תוך כדי הטיית אותה.
   הערה: על ידי ריסוק עדין של משחת השמרים בעזרת צמר גפן, ממיסים אותה למקרה שיימצאו עליה מספר רב של עוברים. התחל לאסוף את העוברים ~40 דקות לפני הקיבוע (בסביבות השעה 11:00 בבוקר).
2. העבירו את העוברים מצלחת הביצה למיקרו-צינור של 1.5 מ"ל באמצעות קצה פיפטה של 1 מ"ל.
3. אפשר לעוברים להתיישב ולשאוף את תמיסת ה-PBT ככל האפשר. שטפו את העוברים פעמיים עם 1 מ"ל תמיסת PBT. שאפו את תמיסת ה-PBT ככל האפשר.
4. מלאו את הצינור ב-1 מ"ל של 50% אקונומיקה (כלומר, מדולל במים נטולי יונים) והסירו את העוברים על ידי דגירה על נוטר למשך 3 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
   הערה: שלב זה אינו הורג את העוברים המפורקים.
5. אפשר לעוברים המפורקים להתייצב, שאפו את האקונומיקה של 50% ככל האפשר, ושטפו את העוברים 3 פעמים עם 1 מ"ל של תמיסת PBT.
6. הוסף 0.5 מ"ל של הפטן ולאחר מכן הוסף 0.5 מ"ל של תמיסת פרפורמלדהיד 4% לצינור ב-RT בסביבות השעה 11:00 בבוקר.
7. דגרו את העוברים על נוט למשך 15 דקות ב-RT.
8. הסר את תמיסת ה-4% פרפורמלדהיד (השכבה התחתונה).
9. הוסיפו 0.5 מ"ל של 100% מתנול והפחיתו את העוברים על ידי ניעור נמרץ של הצינור במשך 30 שניות.
10. הסירו את ההפתן (כלומר, השכבה העליונה).
11. הוסיפו 0.5 מ"ל של 100% מתנול ונערו את הצינור במרץ במשך 10 שניות.
12. אפשרו לעוברים להתיישב על ידי הקשה על הצינור ושאפו את המתנול ככל האפשר. שטפו את העוברים עם 1 מ"ל של 100% מתנול, תוך ניעור במשך פחות מ-10 שניות.
    הערה: חשיפה ממושכת למתנול הורסת את פעילות β-גל.
13. הסר את המתנול ושטוף את העוברים המפורקים 3 פעמים עם 1 מ"ל של תמיסת PBT.

4. גנוטיפ של העוברים באמצעות צביעת LacZ (יום 2)

1. הוסף 1 מ"ל של תמיסת PBT לשפופרת ודגר את הצינור בבלוק חום של 37 מעלות צלזיוס או אמבט מים למשך 15 דקות.
2. במהלך הדגירה, יש להניח תמיסת צביעה X-Gal (1 מ"ל לשפופרת) בטמפרטורה של 65 מעלות צלזיוס באמבט מים עד שהיא נעשית עכורה. דגרו אותו באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס.
3. שאפו את תמיסת ה-PBT והוסיפו 1 מ"ל של תמיסת צביעה X-Gal ו-20 מיקרוליטר של מצע X-Gal לשפופרת.
4. דגרו את הצינור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם אגוזים עד שניכר משקע כחול.
   הערה: זמן הדגירה של המאזנים הכחולים השני והשלישי באופן כללי נע בין 2-4 שעות.
5. הסר את תמיסת הצביעה של X-Gal ושטוף את העוברים 3 פעמים עם 1 מ"ל של תמיסת RT PBT.
6. בעזרת בדיקת מחט או מלקחיים, מיין ידנית את העוברים של הגנוטיפ הרצוי ( כלומר, עוברים לבנים לא מוכתמים) עם מיקרוסקופ מנתח אור (מטרות 1.6X-2.5X).
   הערה: מכיוון שחלק מהמאזנים הכחולים, כגון CyO, actin-LacZ ו-TM3, actin-LacZ, נושאים מבנה טרנסגני המבטא β-גל חיידקי (LacZ) תחת שליטתו של מקדם actin, עוברים שנצבעו בכחול באופן נפוץ מכילים עותק אחד או שניים של כרומוזומי איזון כחולים. לכן, עוברים לבנים שאינם מוכתמים הם הומוזיגוטיים עבור האלל הקטלני הרצוי.

5. צביעה חיסונית של עוברים עם נוגדנים נגד פאסיקלין II (ימים 2-3)

1. אסוף והעביר את העוברים של הגנוטיפ הרצוי (, כלומר, עוברים לבנים לא מוכתמים) למיקרו-שפופרת של 0.5 מ"ל באמצעות קצה פיפטה של 1 מ"ל.
   הערה: בשלב זה, ניתן לשלב את העוברים באופן גס על פי קריטריונים מורפולוגיים, כולל דפוסי הפילוח של הקוטיקולה ומבני הראש והזנב. במהלך התפתחות הראש, בין 10 ל-16 שעות לאחר הטלת הביצים, העובר עובר הפחתה בולטת של המקטע הקדמי.
2. שטפו את העוברים פעם אחת עם 0.4 מ"ל תמיסת PBT והוסיפו 0.3 מ"ל תמיסת חסימה (5% סרום עיזים רגיל ו-5% DMSO בתמיסת PBT).
3. חסום את העוברים עם נוטציה ב-RT למשך 15 דקות.
4. הוסף 75 מיקרוליטר של נוגדן נגד Fasciclin II ודגר את הצינור עם נוטציה ב-RT למשך הלילה.
5. שטפו את העוברים 4 פעמים עם 0.4 מ"ל תמיסת PBT למשך 20 דקות לפחות בכל כביסה.
6. יש להוסיף 0.3 מ"ל של תמיסת חסימה (5% סרום עיזים רגיל בתמיסת PBT) המכילה נוגדן נגד עכברים-חזרת פרוקסידאז (anti-mouse-HRP) (2 מיקרוגרם/מ"ל) ולדגור על הצינור עם נוצה ב-RT למשך הלילה.
7. שטפו את העוברים 6 פעמים עם 0.4 מ"ל תמיסת PBT למשך 20 דקות לפחות בכל כביסה.
8. הוסף 0.3 מ"ל של תמיסת DAB לצינור.
   זהירות: ללבוש כפפות ולהניח את כל הפסולת/צינורות/טיפים של DAB לתוך אקונומיקה.
9. הוסף 2 מיקרוליטר של מי חמצן 3% ודגר את הצינור בחושך עם נוטציה ב-RT עד להפקת כמות המשקעים הרצויה.
   הערה: זמן הדגירה של אימונוהיסטוכימיה 1D4 באופן כללי נע בין 0.5-1 שעות.
10. שטפו את העוברים 4 פעמים עם 0.4 מ"ל של תמיסת PBT.
    זהירות: הסר את תמיסת ה-DAB ואת שתי השטיפות הראשונות עם פיפטה והשליך אותן באקונומיקה.
11. הוסף 0.2 מ"ל של תמיסת גליצרול/PBS 70% לצינור ואחסן ב-RT או 4 מעלות צלזיוס.
    הערה: הרחק את הצינור מאור. ניתן להשיג תכשירים ברורים יותר על ידי הנחת העוברים בתמיסה של 90% גליצרול/PBS. עם זאת, קשה יותר לנתח עוברים שפונו בתמיסת 90% גליצרול/PBS מאשר עוברים שפונו בתמיסת 70% גליצרול/PBS.

6. בימוי, ניתוח, הרכבה והדמיה של העוברים (יום 4)

1. לבימוי, העבירו את העוברים מאוזנים עם 70% גליצרול/PBS על מגלשת זכוכית.
2. אסוף עוברים בשלב מאוחר של 16 בעלי עצבים בין-סגמנטליים של מקטע בטני 7 (A7), A8 ו-A9 המתכנסים כדי לגעת זה בזה או ו/או בעלי מעי אמצעי המחולק לשלוש רצועות.
   הערה: ניתן לביים עוברים מוכתמים בנוגדנים 1D4 על סמך דפוסי ההקרנה של אקסונים מוטוריים ISN ו-ISNb. לאחר היציאה ממערכת העצבים המרכזית (CNS), עצבי ISN A7, A8 ו-A9 של עוברים בשלב מאוחר של 16 מתכנסים כדי לגעת זה בזה ולאחר מכן מתפצלים כדי להתפשט הרחק אל שרירי הגב (ראש חץ ב-איור 1A). בעוברים באמצע שלב 16, לעומת זאת, עצבי ISN A7 משתרעים במקביל לעצבים A8/A9 (סוגריים מרובעים ב-איור 1B). בנוסף, צירי ההקרנה של עצבי ISNb A6 (בניצב לשרירי הגחון) בשני ההמיסגמנטים מיושרים בערך עם הקצה האחורי של פאסיקלי האקסון האורכיים של מערכת העצבים המרכזית (חצים וקו ב-איור 1C). קריטריונים מורפולוגיים אלה משתנים בין גנוטיפים שונים. לחלופין, ניתן לביים עוברים על סמך מורפולוגיה של המעיים. לפני שלב 17, למעי האמצעי יש צורה דמוית לב, ואילו המעי האמצעי מחולק לשלוש רצועות בשלב 17.
3. לנתח את העוברים.
   1. בעזרת מזרק של 1 מ"ל, הוצא כל עובר מטיפת הגליצרול והנח את הגחון של העובר עם הפנים כלפי מעלה. חותכים את החלק הקדמי ב-1/4 מאורך הגוף ואת האזור האחורי ביותר שאינו נקי מאקסונים מוטוריים.
   2. בעזרת בדיקת מחט, הזיזו את העובר שנחתך בקצה טיפת הגליצרול, גלגלו אותו כדי לכוון אותו בצד הגב כלפי מעלה, והניחו אותו אופקית בשדה.
      הערה: כאשר העובר מועבר מטיפת הגליצרול, מעט גליצרול הקשור לעובר הופך אותו לדביק.
   3. חותכים את העובר לאורך קו האמצע הגבי באמצעות מחט טונגסטן דקה מאוד. בצע חתך קטן בקצה האחורי של העובר ולאחר מכן המשך לחתוך את קו האמצע הגבי לכיוון הקדמי; חיתוך בכיוון ההפוך זה גם בסדר.
   4. בעזרת בדיקת מחט, העבירו את העובר שנחתך בקו האמצע לתוך טיפת הגליצרול, הניחו אותו בצד הגב כלפי מעלה, ונתקו את המעי מדופן הגוף על ידי פתיחת כל דופן גוף בכיוון גחון (אלכסוני) (מטרה פי 2.5).
      הערה: ודא שקו האמצע הגבי נחתך במלואו, וכתוצאה מכך ההפרדה המלאה בין דופן הגוף השמאלית והימנית.
   5. הזיזו בזהירות את העובר שנחתך בקו האמצע מתוך טיפת הגליצרול ולאחר מכן הניחו שני דשים של דופן הגוף כלפי מטה על מגלשת הזכוכית באמצעות בדיקת מחט דקה (מטרה פי 2.5).
   6. בעזרת מחט טונגסטן דקה מאוד, הסר את האיברים הפנימיים מהעובר המנותח על ידי דחיפתם לרוחב (מטרה פי 5).
      הערה: תיאור מפורט יותר של הליך נתיחה דומה אחר ניתן למצוא באתר.
4. להרכבה, הוסף 2-3 מיקרוליטר של תמיסת 70% גליצרול/PBS לעוברים נקיים ומנותחים ובאמצעות בדיקת מחט עדינה, העביר אותם למגלשת זכוכית חדשה שעליה נמרחו 8 מיקרוליטר של תמיסת 70% גליצרול/PBS במרכז (מטרה פי 2.5).
5. שים כיסוי (18 מ"מ על 18 מ"מ). אטום את שולי הכיסוי עם לק רגיל (שקוף או צבעוני זה בסדר).
6. צלם תמונות ברזולוציה גבוהה (יעדי טבילה בשמן, 20X, 40X ו-63X) תחת מיקרוסקופ אור עם ניגודיות הפרעות דיפרנציאליות (DIC), בהתאם להוראות היצרן.
   הערה: ניתן לייצר הדמיה ואפיון פנוטיפי טובים יותר, במיוחד עבור אקסונים מנועיים של ISNb, על ידי שימוש במטרה של טבילת שמן פי 63.

Results

איור 1: שלב של עוברים על סמך דפוסי ההקרנה של אקסונים מוטוריים ISN ו-ISNb. (A) בשלב מאוחר של עוברים מסוג בר 16, עצבי ISN A7, A8 ו-A9 מתכנסים כדי לגעת זה בזה (ראש חץ). הקדמי שמאלי והגחון למטה. סרגל קנה המידה = 15 מיקרומטר. (B

Materials