הדמיה in vivo של מוח זחל דג הזברה להדמיית נוירונים במוח הקטן

תקציר

מקור: Schramm, P. et al. הדמיה in vivo של רקמת מוח פעילה לחלוטין בזחלים וצעירים של דג זברה ער על ידי הסרת גולגולת ועור. J. Vis. Exp. (2021)

סרטון זה מדגים את ההדמיה in vivo של נוירונים במוח הקטן בזחלי דג זברה טרנסגניים, המבטאים חלבונים פלואורסצנטיים בנוירונים של פורקיניה. התהליך כולל הרדמת הזחלים, שיתוקם באגרוז והסרה זהירה של העור הפיגמנטי כדי לשפר את חדירת האור ועוצמת הקרינה. לבסוף, הדגימות המוכנות מצולמות תחת מיקרוסקופ קונפוקלי כדי לדמיין את הנוירונים המסומנים בבירור.

פרוטוקול

כל ההליכים הכוללים מודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ומועצת הביקורת הווטרינרית של JoVE.

1. הרדמה של זחלים והכנות להטמעה
   1. כאשר מתחילים את הניסוי לאותו יום, העבירו את החיות הדרושות עם פיפטת פסטר מפלסטיק לצלחת פטרי בקוטר 90 מ"מ, אשר ממולאת בדניאו (לזחלים שעדיין מוחזקים בצלחת פטרי עם דניו) או במים ממתקן הדגים (לזחלים שגילם עולה על 7 ימים לאחר ההפריה [dpf] ונשמרים במתקן הדגים).
      1. כאשר פיפטינג דגים מעל שבועיים, ודא שפתח הפיפטה גדול מספיק כדי למנוע פציעה של הדגים בעת העברתם. אל תשתמש ברשת מכיוון שהיא תפגע פיזית בדגים, במיוחד בזחלים הצעירים יותר.
   2. הוסיפו rotifera או artemia נאופלי המתאים לגודל הזחלים המאוחסנים בצלחת הפטרי כדי להבטיח גישה חופשית למזון ומצב בריאותי מקסימלי של הזחלים ולהפחית את הלחץ.
   3. להטמעה, העבירו את הזחלים שנבחרו לצלחת פטרי בקוטר 35 מ"מ מלאה בנוזל מוחי מלאכותי (ACSF). הוסיפו את הנפח הדרוש של d-Tubocurarine כדי להגיע לריכוז עובד/מינון אפקטיבי של 10 מיקרומטר והמתינו מספר דקות עד שהזחלים ישותקו לחלוטין.
      הערה: כאשר הדגים מתבגרים או אם יש צורך בהרדמה מלאה מהירה יותר (פחות מ-5 דקות), ניתן להעלות את ריכוז ה-d-Tubocurarine (LD50 לעכברים הוא 0.13 מ"ג/ק"ג תוך ורידי). אפשר גם להשתמש בחומר הרדמה אחר, כגון α-bungarotoxin (ריכוז עבודה: 1 מ"ג/מ"ל), שיש לו השפעה זהה לקוררה וגם שומר על המוח פעיל לחלוטין. אם מוח פעיל לחלוטין אינו נחוץ לנושא העניין, טריקאין במינון לא קטלני (0.02%) הוא גם אפשרות להרדמה מלאה של הזחלים. עם זאת, טריקאין חוסם תעלות נתרן, ובכך פוגע בפעילות המוח.
   4. הכן את תא ההרכבה על ידי לקיחת המכסה של צלחת הפטרי בקוטר 35 מ"מ, הפוך את המכסה והנח כיסוי זכוכית מרובע (24 x 24 מ"מ) בתחתית המכסה. ראה איור 1 (החלק העליון) לתיאור סכמטי של שלבים אלה. המשטח החלק יותר של הזכוכית מונע החלקה מגוש האגרוז, המכיל את הזחלים במהלך הליך פתיחת הגולגולת.
   5. ציין את כמות ה-ACSF הדרושה ליום בבקבוקון מתאים (למשל, שפופרת 50 מ"ל, כוס, בקבוק שוט וכו') וחמצן אותו עם קרבוגן (5% CO₂, 95% O₂). אם הדמיה רק מורפולוגיה (למשל, דפוסי פלואורסצנטיות) ACSF עדיין נחוץ כדי להבטיח את שלמות המוח וכי התאים אינם מושפעים לרעה מהשפעות אוסמולריות אך אין צורך בחמצון של ה-ACSF. שלב זה צריך להתבצע רק כאשר פעילות מוחית מלאה נחוצה לצורך הדמיה.
      הערה: לרוויית חמצן אופטימלית של המדיום, הוסף אבן אוויר לקצה צינור הקרבוגן. כדי להבטיח רמת חמצן גבוהה מספיק, יש צורך להחליף את ה-ACSF בתאי ההדמיה ב-ACSF מחומצן טרי כל 20-60 דקות, תלוי במספר וגיל הזחלים המוטבעים באותו תא הדמיה (למשל, עבור זחל מוטבע יחיד החלפת ACSF כל שעה מספיקה. עבור שישה זחלים שגילם מעל 14 dpf משובצים במקביל, יש צורך בהחלפת ACSF כל 20 דקות) אז תכננו את הכמות הדרושה של ACSF רווי חמצן בהתאם לניסוי המתוכנן.
2. הטמעת הזחלים
   1. העבר את הזחלים המורדמים לחלוטין עם פיפטת פסטר מפלסטיק לתא ההרכבה המוכן (בשלב 1.4). לאחר מכן, הסר בזהירות את המדיום העודף כדי למנוע דילול של אגרוז ההיתוך הנמוך (LM). יש לבצע את כל השלבים הבאים תחת מיקרוסקופ סטריאו עם הגדלה מספקת.
      הערה: הטיית תא ההרכבה יכולה לעזור להסיר את המדיום במלואו.
   2. המשיכו מיד לשלב הבא, על ידי הוספת טיפת LM-agarose גדולה מספיק על גבי הזחלים (כ-1 מ"ל, תלוי בגודל הזחלים) כדי להגן על בעלי החיים מפני התייבשות ולהפחית מתח מיותר.
   3. כוון את הזחלים למקומם לפני שהאגרוז מתמצק. ודא שהחלק הגבי של הזחלים מופנה כלפי מעלה. כמו כן, הקפידו להטמיע את הזחלים קרוב ככל האפשר לפני השטח של האגרוז.
      הערה: בהתאם לגודל ולמספר הזחלים המתוכננים להטמיע בו זמנית, ניתן להתאים את ריכוז האגרוז. לדוגמה, עבור 1-3 זחלים בני 30 dpf, מומלץ ריכוז של 1.8%-2% LM-agarose. עבור 1-4 זחלים בני 7 dpf, הכי מעשי להשתמש ב-2.5% LM-agarose, בעוד שעבור 5-8 זחלים, 2% מתאים יותר. אם נדרש מוח פעיל לחלוטין, מומלץ להטמיע רק שלושה דגים בו זמנית כדי להפחית את הזמן הדרוש להפעלת הזחלים. באופן כללי, מומלץ להשתמש בריכוזים נמוכים יותר (1.8%-2%) ככל שהזחלים מתבגרים, או שמתוכננים להטמיע יותר זחלים במקביל.
   4. אם התמונות מוקלטות באמצעות מיקרוסקופ הפוך, חתוך את גוש האגרוז המכיל את הזחלים לצורה קובייה קטנה. זה חשוב להעברת הזחלים לתא ההדמיה מאוחר יותר. אם משתמשים במיקרוסקופ זקוף, אין צורך בחיתוך כזה, מכיוון שתא ההרכבה יכול לשמש גם כתא ההדמיה. באיור 1 (החלק העליון), ניתן למצוא תיאור סכמטי של שלבים אלה.
3. חשיפת המוח
   הערה: יש לבצע את כל הצעדים הבאים בזהירות רבה כדי לא לפגוע בזחלים שלא לצורך. אם נדרש מוח פעיל לחלוטין לניסוי, זכרו שעם כל שנייה שעוברת, בזמן שהדג עדיין רכוב במלואו באגרוז ויש לו גולגולת פתוחה ללא ACSF מחומצן, המוח יסבול ממחסור בחמצן ויתייבש. ההשפעות של מחסור בחמצן יהפכו דרמטיות עוד יותר ככל שהזחלים המוטבעים יהיו מבוגרים יותר. לכן, חשוב לבצע את הניתוח לא רק בזמן הקצר ביותר האפשרי, אלא גם בדיוק מירבי כדי למנוע נזק מוחי מכני עם המחט. שלבים 3.2-3.4 לא צריכים לקחת יותר מ-30 שניות לדג בעת אימון.
4. התחל את הניתוח ברגע שהאגרוז התמצק. ראשית, חתוך את כל האגרוז העודף מעל אזור המוח המעניין כדי לקבל גישה חופשית לראש ומרחב עבודה פנוי. אם החלק הגבי של הראש כבר בולט מהאגרוז, דלג על שלב זה.
5. בהתאם לאזור העניין, בחר מקום להתחיל בו עם הניתוח. קח את מחט הזכוכית ובצע חתך קטן דרך העור מבלי לחדור עמוק מדי לתוך הרקמה. זו תהיה נקודת ההתחלה לקילוף העור המכסה.
   הערה: לקבלת תוצאות מיטביות, לעולם אל תתחיל ישירות מעל אזור העניין כדי להפחית את הסיכון לפגיעה במבנים חשובים. במידת הצורך, ניתן להתחיל אחורי למוח האחורי ולעבוד קדימה עד לקילוף אזור העור הלא רצוי.
6. המשיכו עם חתכים קטנים מאוד לאורך חלק העור, במטרה להסיר על ידי הזזת המחט בקושי מתחת לפני השטח. רוב הזמן אין צורך לנוע לגמרי סביב המוח ולחתוך פיסת עור וגולגולת דמויי עיגול, אלא פשוט לעשות שני חתכים לאורך הראש ואז לדחוף את העור לצד זה או אחר. איור 2 מציג ייצוג סכמטי של אסטרטגיית החיתוך האופטימלית להשגת גישה חופשית למוח הקטן.
   הערה: מיקרו-כירורגיה זו היא הליך עדין, וסביר להניח שהיא תזדקק להכשרה מסוימת כדי להסיר את העור בצורה מושלמת מבלי לפגוע במוח הבסיסי. כמו כן, מומלץ למצוא את אסטרטגיית החיתוך האופטימלית לאזור המוח המעניין ולהיצמד אליה למשך הניסוי.
7. מיד לאחר הסרת העור מכל הזחלים המוטבעים, שפכו ACSF (מחומצן) על האגרוז כדי להציף חלקיקי עור ודם לא רצויים, לשמור על המוח פעיל לחלוטין ולהגן עליו מפני התייבשות.
   הערה: אם יש צורך במוח בריא לניסוי, מומלץ ללכת על מקסימום שלושה דגים בכל פעם.
8. אם אתה משתמש במיקרוסקופ זקוף, התחל ישירות בהדמיה.
   1. בעת שימוש במיקרוסקופ הפוך, החלק מרית קטנה מתחת לגוש האגרוז הקובייתי (שלב 2.4).
   2. הוסף טיפה קטנה של LM-agarose לתחתית תא ההדמיה (למשל, צלחת עם תחתית זכוכית) והפוך מיד את גוש האגרוז המכיל את הזחלים עם המרית למשך 180 מעלות ודחף אותו בעדינות לתחתית תא ההדמיה, בעוד טיפת האגרוז הנוזלית משמשת כדבק.
   3. כאשר האגרוז התמצק, מלאו את תא ההדמיה ב-ACSF (מחומצן) ולאחר מכן התחילו בהדמיה. ראה איור 1 (החלק התחתון) לתיאור סכמטי.
9. כאשר נדרשת פעילות מוחית מלאה לניסוי, ודא תמיד של-ACSF בתא ההדמיה יש רמת חמצן גבוהה מספיק. כדי להבטיח זאת, יש להחליף את המדיום בזהירות עם ACSF מחומצן טרי כל 20-60 דקות (תלוי במספר וגודל הדגים, גודל ומשטח תא ההדמיה ומשך ההדמיה).

תוצאות

איור 1: הליך סכמטי להכנת דג זברה גולגולת פתוח להדמיית in vivo} באופן מדורג. ניתן למצוא את הוראות העבודה עבור השלבים השונים בגרפיקה עצמה. גרפיקה שעוצבה על ידי פלוריאן הץ' ועובדה על ידי פול שראם.

<...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי	Leica	TCS SP8
d-Tubocurare	Sigma-Aldrich	T2379-100MG
נימי זכוכית מסוג 1	WPI	1B150F-4
זכוכית נימי סוג 2	הרווארד מכשיר	GC100F-10
זכוכית Coverslip	deltalab	D102424
תא הדמיה	Ibidi	81156
LM-Agarose	Condalab	8050.55
מיקרוסקופ מצלמה	Leica	DFC9000 GTC
חולץ מחט סוג 1	NARISHIGE	דגם PC-10
חולץ מחט סוג 2	מכשירי סאטר	דגם P-2000
פסטר-פיפטות 3 מ"ל	A.Hartenstein	20170718
Tricain	Sigma-Aldrich	E10521-50G
35 מ"מ צלחת פטרי	Sarstedt	833900
90 מ"מ צלחת פטרי	Sarstedt	821473001