אפיון התכונות המכניות של רקמת מוח של עכבר באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי

תקציר

מקור: Canovic, E. P., et al. אפיון תכונות מכניות רב-ממדיות של רקמת המוח באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי, הזחת פגיעה וריאומטריה. J. Vis. Exp. (2016)

סרטון זה מדגים את השימוש במיקרוסקופ כוח אטומי (AFM) למדידת התכונות הויסקו-אלסטיות של רקמת המוח, כאשר שלוחה עם בדיקה כדורית מקיימת אינטראקציה עם הרקמה ומתכופפת תחת כוחות מופעלים. קרן לייזר המוסטת על גבי גלאי עוקבת אחר השלוחה כדי למדוד את עומק השקע והרפיית הכוח, מה שמאפשר לאפיין את התכונות המכניות של הרקמה.

פרוטוקול

כל ההליכים הכוללים דגימות של בעלי חיים נבדקו ואושרו על ידי ועדת הביקורת האתית המתאימה לבעלי חיים.

1. כניסה התומכת במיקרוסקופ כוח אטומי (AFM)

1. הכן צלחות פטרי בקוטר 60 מ"מ (P60) עם דבק ביולוגי שמקורו במולים לפי הוראות היצרן.
   1. הכן מלאי של תמיסת חיץ ניטרלית המורכבת מ-0.1 M נתרן ביקרבונט במים סטריליים עם pH אופטימלי של 8.0. יש לעקר מסנן (0.2 מיקרון) את מאגר הנתרן ביקרבונט ולאחסן אותו בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
   2. במכסה זרימה למינרית, מערבבים תמיסה של 6.25% דבק ביולוגי שמקורו במולים ו-3.125% נתרן הידרוקסיד (NaOH) במאגר הנתרן ביקרבונט.
   3. פיפטה 100μl של תמיסת הדבק הביולוגי על צלחת פטרי בקוטר 60 מ"מ (P60) והשתמש בקצה פיפטה כדי לפזר את התמיסה לעיגול בקוטר 3-5 ס"מ.
   4. השאירו את כלי P60 חשופים בקולט אדים למינרי ותנו לתמיסה להתייבש (~30 דקות). שטפו את הכלים 1x עם מי מלח עם חוצץ פוספט (PBS) ו-2x עם מים סטריליים. יש להניח לכלים להתייבש באוויר בקולט אדים ולאחסן אותם בשקית ניילון אטומה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך עד חודש.
2. כייל את ה-AFM והגדר דגימת מוח ב-AFM. הערה: עקוב אחר הוראות כיול AFM לפי היצרן.
   1. טען בזהירות בדיקת AFM עם קבוע קפיץ נומינלי של 0.03 N/m וחרוז בורוסיליקט בקוטר 20 מיקרומטר לתוך מחזיק הבדיקה.
   2. כייל את קבוע הקפיץ ואת רגישות המנוף האופטי ההפוך (InvOLS) של שלוחת AFM בשיטת הכוונון התרמי.
      הערה: לאחר חישוב קבוע הקפיץ עבור בדיקת AFM, הוא אמור להישאר קבוע בשימוש חוזר. עם זאת, יהיה צורך לכייל מחדש את ה-InvOLS השלוחה בכל פעם שהלייזר מיושר מחדש עם השלוחה בנוסף, יש לבצע כיול כנגד מצע קשיח בכמה סדרי גודל מהשלוחה, כגון פוליסטירן.
   3. הפעל את התנור המותקן על הבמה והגדר את הטמפרטורה ל-37 מעלות צלזיוס.
   4. הרכיבו את פרוסת המוח על צלחות P60.
      1. יוצקים בעדינות פרוסת מוח בעובי 350 מיקרומטר ואת המדיום הבלתי תלוי בפחמן דו חמצני (CO₂) מהבקבוק התחתון העגול לתוך צלחת P60 המצופה בדבק הביולוגי שמקורו במולים.
      2. מקם את פרוסת המוח במרכז צלחת P60 על ידי הטיה עדינה. במידת הצורך, פיפטה איטית את המדיום מפיפטה ידנית כדי לפרוש פרוסת מוח שהתקפלה על עצמה, או יותר טוב, מקם את פרוסת המוח במרכז הצלחת.
      3. הסר בזהירות את המדיה העודפת באמצעות פיפטה P1000 (אל תשתמש בוואקום).
      4. מניחים מכסה על צלחת P60 ונותנים לפרוסת המוח להידבק למשך 20 דקות.
   5. הסר את ראש ה-AFM, הנח את פרוסת המוח המותקנת בצלחת P60 על ה-AFM tagה, והוסף ~2 מ"ל מדיום שאינו תלוי ב-CO₂ מחומם מראש.
   6. הוסף בזהירות טיפת מדיה על בדיקת ה-AFM כדי להגן עליה מפני שבירה עקב מתח פנים כאשר היא מונמכת לתוך המדיה המקיפה את פרוסת המוח.
   7. מקם מחדש את ראש ה-AFM על ה-tagה והתחל להוריד את הראש עד שהוא שקוע במדיה.
   8. באמצעות החלק העליון view מצלמת מכשיר מצמד טעינה (CCD), מקם מחדש את הלייזר על השלוחה
      הערה: יישור הלייזר על השלוחה ישתנה מעט עקב ההבדל במקדם השבירה של אוויר ומדיום.
   9. המתן 5 דקות עד שהשלוחה תסתגל לטבילה בנוזל חם, ולאחר מכן אפס את יישור המראה לסטייה חופשית של 0 וולט.
   10. הפעל ספקטרום תרמי על בדיקת AFM בהתאם להוראות היצרן. השתמש בהתאמה של השיא התרמי הראשון כדי לחשב מחדש את ה-InvOLS של בדיקת ה-AFM במדיה.
   11. באמצעות המיקרוסקופ האופטי, הזיזו את שלב הדגימה כך שהאזור המעניין במוח יהיה מתחת לבדיקת AFM. הערה: הקורפוס קלוסום ייראה כהה מכיוון שהוא אטום יותר מהחומר האפור שמסביב. קליפת המוח עדיפה על הקורפוס קלוסום.
   12. אפס את יישור המראה לסטייה חופשית של 0 V.
   13. במד הסכום והסטייה בתוכנת AFM, לחץ על "Engage" כדי להפעיל את ראש ה-AFM.
   14. בעזרת חוגת המיקום בראש ה-AFM, הורד את הראש עד שנוצר מגע בין השלוחה לדגימה.
3. ערכו ניסויי תאימות לזחילה.
   1. בנה פונקציית כוח מופעל בעורך הפונקציות של התוכנה. פונקציית הכוח מורכבת מרמפה של 0.1 שניות לנקודת הגדרה של 5 nN והחזקתה למשך 20 שניות, ואחריה רמפה של 1 שנייה למטה לכוח מופעל של 0 nN.
      1. בלוח הראשי של הזחה, תחת שיטת הכניסה, בחר "טען" עבור מצב Indenter, "N" עבור יחידות ו-"עורך פונקציות" עבור פונקציית Indenter.
      2. בעורך הפונקציות, בלוח Segment Parms, צור קטע פונקציית כוח מופעל שמתחיל ב-0 nN ומסתיים ב-5 nN, עם זמן של 0.1 שניות>.
      3. עבור הקטע הבא, הגדר את ההתחלה ל-5 nN, את הסוף ל-5 nN ואת הזמן ל-20 שניות>.
      4. עבור הקטע האחרון, הגדר את ההתחלה ל-5 nN, את הסוף ל-0 nN ואת הזמן לשנייה אחת. לאחר מכן, לחץ על "צייר" וסגור את חלון עורך הפונקציות.
   2. בלשונית הכוח של הפאנל הראשי, סמן את "indenter ramp after trigger" והגדר את פונקציית הכוח המופעלת להפעלה לאחר הגעה לנקודת טריגר של 0.1 V.
   3. לחץ על "כוח בודד" בתחתית לשונית הכוח של הפאנל הראשי, שתפעיל את פונקציית הכוח המופעלת הבנויה לתאימות זחילה.
   4. לאחר סיום כניסת הכוח היחיד, הרם את ראש ה-AFM כך שהוא לא יהיה במגע עם הדגימה. לאחר מכן, הפעל מחדש את הראש ואפס מחדש סטייה חופשית.
   5. מקם מחדש את שלב הדגימה כדי לאתר אזור עניין חדש והורד את ראש ה-AFM כדי ליצור מגע. הערה: יש להחזיר את ראש ה-AFM ממשטח הדגימה בעת הזזת הדגימהtagה. אי ביצוע זה עלול לגרום לנזק לשלוחה העדינה של AFM.
   6. חזור על השלבים עד לאיסוף כמות הנתונים הרצויה.
4. ערוך ניסויי הרפיית כוח.
   1. בנה פונקציית הזחה מוחלת בעורך הפונקציות של התוכנה. פונקציית ההזחה מורכבת מרמפה של 0.1 שניות לנקודת הגדרה של 3 מיקרומטר והחזקתה למשך 20 שניות, ואחריה שיפוע של שנייה אחת למטה לעומק כניסה של 0 מיקרומטר.
      1. בלוח האב לכניסה, תחת שיטת הכניסה, בחר "כניסה" עבור מצב Indenter, "m" עבור יחידות ו"עורך פונקציות" עבור פונקציית Indenter.
      2. בעורך הפונקציות, בלוח Segment Parms, צור קטע פונקציית כוח מופעל שמתחיל ב-0 מיקרומטר ומסתיים ב-3 מיקרומטר, עם זמן של 0.1 שניות. לחץ על "הוסף -->".
      3. עבור הקטע הבא, הגדר את ההתחלה ל-3 מיקרומטר, סוף ל-3 מיקרומטר והזמן ל-20 שניות. לחץ על "הוסף -->".
      4. עבור הקטע האחרון, הגדר את ההתחלה ל-3 מיקרומטר, את הסוף ל-0 מיקרומטר ואת הזמן לשנייה אחת. לאחר מכן לחץ על "צייר" וסגור את חלון עורך הפונקציות.
   2. בלשונית הכוח של הפאנל הראשי, סמן את "indenter ramp after trigger" והגדר את פונקציית הכוח המופעלת להפעלה לאחר הגעה לנקודת טריגר של 0.1 V.
   3. לחץ על "כוח בודד" בתחתית לשונית הכוח של הלוח הראשי כדי להפעיל את פונקציית הכניסה המופעלת הבנויה להרפיית כוח.
   4. לאחר סיום הכניסה בכוח יחיד, הרם את ראש ה-AFM כך שיהיה מחוץ למגע עם הדגימה, ולאחר מכן הפעל מחדש את הראש ואפס מחדש את הסטייה.
   5. מקם מחדש את הבמה כדי לאתר אזור עניין חדש והורד את הראש כדי ליצור מגע.
   6. חזור על שתי המדידות עד לאיסוף כמות הנתונים הרצויה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
Hibernate-A medium	Gibco	A1247501	COמדיום עצבי בלתי תלוי לרקמות בוגרות
מיקרוסקופ כוח אטומי, MFP-3D-BIO	Asylum Research	-
מחמם צלחות פטרי	מחקר מקלט	-
בדיקת AFM, 0.03 N/m, רדיוס 10 אום כדור בורוסיליקט	Novascan	PT.
Cell-Tak	Corning	354240	דבק ביולוגי שמקורו בצדפות
נתרן ביקרבונט	Sigma-Aldrich	S5761	ניתן להשתמש בספקים חלופיים
נתרן הידרוקסיד, 1N	Sigma-Aldrich	59223C	ניתן להשתמש בספקים חלופיים

GS