Multiparametric מיפוי אופטי של הלב Langendorff-perfused הארנב

סיכום

מאמר זה מתאר את ההליכים הבסיסיים לעריכת ניסויים מיפוי אופטי בלב Langendorff-perfused הארנב באמצעות מערכת הדמיה פנורמית, ואת שיטת כפול (מתח סידן) הדמיה.

תקציר

דימות אופטי בדיקות ניאון יש שיטות מחקר מתקדמות באופן משמעותי בתחום electrophysiology לב בדרכים לא יכול היה להיות מושלם על ידי גישות אחרות ^1. עם השימוש של צבעים סידן מתח רגיש, מיפוי אופטי המאפשר מדידת פוטנציאל פעולה הטרנסממברני ו הארעיים סידן עם רזולוציה מרחבית גבוהה ללא מגע פיזי עם הרקמה. זה עושה מדידות של הפעילות החשמלית לב אפשרי בתנאים רבים בהם את השימוש של אלקטרודות לא נוח או אפשרי ^1. לדוגמה, הקלטות אופטי לספק שינויים מורפולוגיים מדויק של פוטנציאל הממברנה במהלך ומיד לאחר הגירוי דפיברילציה, בעוד טכניקות אלקטרודה קונבנציונאלי סובלים מגירוי-Induced חפצים במהלך ואחרי גירויים בגלל הקיטוב אלקטרודה ^1.

הלב Langendorff-perfused הארנב הוא אחד הדגמים למד רוב פיזיולוגיה פתופיזיולוגיה הלב האנושי. סוגים רבים של הפרעות קצב שנצפו קלינית יכול להיות סיכם במודל לב שפן. זה היה הראו כי תבניות גל בלב ארנב במהלך הפרעות קצב הלב, נקבעת על ידי גודל אפקטיבי של הלב ואת אורך הגל של החזרה, דומים מאוד כי ² לב האדם. זה היה הראו גם כי היבטים קריטיים של התכווצות, עירור (EC) צימוד ארנב שריר הלב, כגון התרומה היחסית של reticulum sarcoplasmic (SR), דומה מאוד צימוד EC האדם ^3. כאן אנו מציגים את הנהלים הבסיסיים של ניסויים מיפוי אופטי Langendorff-perfused לבבות ארנב, לרבות התקנת המערכת זלוף Langendorff, הגדרת מערכות אופטיות המיפוי, בידוד cannulation של זלוף הלב, צבען צביעה של התכווצות, עירור, לב קשירה והתרה, וכן אוסף של אותות אופטיים. שיטות אלה יכול להיות מיושם גם ללב ממינים אחרים מאשר ארנב עם התאמות ספיקות, אופטיקה, פתרונות וכו '

שתי מערכות מיפוי אופטי מתוארים. מערכת מיפוי פנורמי משמש כדי למפות את epicardium כל הלב ארנב ^4-7. מערכת זו מספקת מבט גלובלי של האבולוציה של מעגלים ההולך ושב במהלך arrhythmogenesis ו דפיברילציה, נעשה שימוש כדי לחקור את המנגנונים של הפרעות קצב ו antiarrhythmia טיפול ^8,9. מערכת מיפוי כפול משמש כדי למפות את פוטנציאל הפעולה (AP) וסידן חולף (CAT) בו זמנית באותו שדה הראייה ^10-13. גישה זו שיפרה את ההבנה שלנו של התפקיד החשוב של הסידן alternans חשמל הגיוס של הפרעות קצב ^14-16.

פרוטוקול

1. הכנה

1. הכן טרי פתרון Tyrodes 'עשה (ב מ"מ, 128.2 NaCl, 1.3 CaCl _2, 4.7 KCl, 1.19 לאא ₂ PO _4, 1.05 MgCl _2, 20.0 NaHCO _3, ו - 11.1 גלוקוז). כדי לזרז את הכנת יומי של פתרונות, שני פתרונות להכין מלאי מראש ולאחסן אותם במקרר 4 ° C: (1) במלאי אני (ב g/2L, 374.6 NaCl, 9.56 CaCl _2, 17.52 KCl, 8.21 לאא ₂ PO ₄ , 10.67 MgCl ₂₎ ו (2) מלאי II (ב g/2L, 84.01 NaHCO _3). כדי להפוך את 2L של פתרון מספיק עבור ניסוי אחד לקחת "Tyrodes 1840mL מים לערבב deionized ובו 80mL של צילומים אני, 80mL של מלאי השנייה, 4 גרם של גלוקוז.
2. הכינו פתרונות המניות של צבעים uncouplers: (1) עירור-התכווצות blebbistatin uncoupler מניות פתרון (Tocris פתרון Bioscience, 2mg/mL ב DMSO); (2) מתח רגיש לצבוע di-4-ANEPPS פתרון מניות (Invitrogen, 1mg/mL פתרון DMSO) (3) מתח רגיש לצבוע RH 237 מניות פתרון (Invitrogen, פתרון 1.25mg/ml ב DMSO); (4) אינדיקטור סידן Rhod, 02:00 פתרון מניות (Invitrogen, פתרון 1mg/ml ב DMSO). ניסוי ארנב בודד דורש כ 30 μL של פתרון di-4-ANEPPS המניות, 30 μL של פתרון RH237 המניות, ו 200 μL של הפתרון Rhod 02:00 מניות. כדי למנוע קפיאה חוזרות הפשרה, אנו מאחסנים 100 aliquots μL של di-4-ANEPPS ב -20 ° C. צבעים אחרים מאוחסנים גם ב -20 ° C. חנות blebbistatin מומס במקרר 4 מעלות צלזיוס.
3. לפני הקציר, הלב פתרון Tyrodes "להעביר לבקבוק 2L ולמקם אותו לתוך אמבט מים (פישר סיינטיפיק) אשר שומרת על הטמפרטורה פתרון ב 37 ° C. הפתרון הוא מחומצן עם 95% O ₂ - 5% CO _2. PH נשמר 7.35 ± 0.05 על ידי התאמת רמת חמצון. הפתרון הוא הופץ במערכת זלוף Langendorff ו מסוננים לפי מסנן רשת ניילון (גודל הנקבוביות: 11μm, Millipore) ממוקם בקו זלוף לפני צינורית.
4. הכינו ציוד ניטור לפני קצירת הלב. מתמר לחץ (WPI) משמש כדי לפקח על הלחץ אבי העורקים במהלך הניסוי. Baseline של מתמר הלחץ מותאם אפס מ"מ כספית כאשר הלב אינו מחובר למערכת זלוף. פסיאודו א.ק.ג. אלקטרודות ממוקמות בחדר עופרת משוער I, II ו-III של המשולש Einthoven אק"ג.

2. קציר זלוף הלבבות הארנב

1. תקן ארנב עוצר הארנב. להרדים את הארנב על ידי הזרקה תוך ורידית של הפרין pentobarbital נתרן (50 מ"ג / ק"ג) עם U 2000. כאשר הארנב מורדמים לגמרי, אשר נקבע על ידי היעדר רפלקס הכאב, חלל בית החזה נפתח במהירות את הלב והריאות הן נכרת.
2. ביצוע חתך בקצה העליון של האאורטה עולה לפני כל הסניפים של קשת אבי העורקים. רוקן את האוויר מן האאורטה עולה ולאחר מכן במהירות cannulate את הלב 16-מד הצינורית, אשר חובר בעבר הצייד בועה כי חשוב מאוד לשמור על האוויר של התקפי לב. לאחר הלב perfused retrogradely במערכת Langendorff הלא הסירקולציה המחודשת זלוף, לעשות חתך כדי לפתוח את קרום הלב במהירות.
3. הסר את הריאות, קנה הנשימה, שומן, רקמות החיבור, ואילו דם הוא הסמיק על ידי זלוף.
4. חשוב מאוד! צינורות סיליקון (~ ארוך 3 ס"מ, ו - 2 מ"מ בקוטר) מוחדר דרך וריד ריאתי שסתום צניפי לתוך החדר השמאלי (LV) והמשיך שם לאורך הניסוי. צינור זה משחרר את הפתרון כי הוא לכוד בתוך LV. ללא מחזור במשך שעות במהלך הניסוי Langedorff-זלוף בלב משותקת מכנית, היא עלולה לגרום איסכמיה קשה בחלל LV כדי לייצר הפרעות קצב.
5. הזז את הלב עם צינורית למערכת Langendorff-זלוף הסירקולציה המחודשת עם מנגנון מיפוי אופטי.

3. ביצוע ניסויים באמצעות מערכת מיפוי אופטי פנורמי

1. מניחים את הלב בתא מחוייט משושה ולחבר את הצינורית למערכת זלוף. שמור את הלחץ על העורקים 60 ± 5 מ"מ כספית על ידי התאמת קצב הזרימה של המשאבה זלוף. צג להוביל אני פסאודו אק"ג. שמירה על pH בסביבות 7.35 ± 0.05.
2. כבה את האור בחדר, כי הוא blebbistatin photoinactivated עד סוף UV נמוכה (450-490 ננומטר) ¹⁷ של החלק הנראה של הספקטרום. לאט לאט להזריק פתרון מניות blebbistatin דרך נמל הזרקת הצייד אוויר הבועה הממוקם מעל הצינורית. לאט לאט להזריק blebbistatin 0.1ml להזרקה כל בולוס. חכו הלחץ לייצב לפני הזריקה הבאה.
3. בעדינות במקום אלקטרודה צעדה על מיקום ספציפי עיצוב ניסיוני שלך.
4. פוקוס את התמונה של הלב בזכוכית חלבית הממוקמת המטוס תמונה של מערך צילום דיודה כל (PDA) משלושהמחולקת באופן שווה זוויות המקיפים את הלב. התאם את המיקום של הצינורית ואת המרחקים בין מחשב כף יד כל הלב, כדי להתאים את הלב את התצוגה של השדה של כל שלושת מחשבי כף יד. קח תמונה של כל תמונה ממוקדת הזכוכית החלבית.
5. לאט לאט להזריק 10 ~ 20μL di-4-ANEPPS פתרון מניות דרך נמל הזרקת במלכודת אוויר לתוך הבועה הפתרון זלוף. חכו 1 ~ 3 דקות לפני נטילת הקלטות אופטי.
6. עבור הקלטת הראשונה, להפוך את הנורית הירוקה (ללא פילטר עירור, LED המבול, Lumileds) על, לקחת הקלטות אופטיים בו זמנית שלושה מחשבי כף יד הקשורים למערכת נתונים מחוייט הרכישה, ⁵ ו לכבות את הנורית. בדוק את איכות אותות מן פיקסלים שונים של כל שלושת מחשבי כף יד. הוסף 0.1 ~ 0.2mL מניות פתרון blebbistatin אם ממצא תנועה בתוך פוטנציאל הפעולה האופטיים הם לב. הוסף עוד 5 פתרון μL di-4-ANEPPS המניות אם אות לרעש יחס נמוך.
7. סיום פרוטוקול הניסוי נועד למחקר פונקציונלי. Re-להכתים את הלב עם פתרון מניות נוספות di-4-ANEPPS 5μL אם האות מידרדר במהלך הניסויים בשל photobleaching או כשלון.
8. כבה את האור בחדר לאחר השלמת המחקר תפקודית. צלמו תמונות של הלב מ -36 זוויות מחולקת באופן שווה. זו מושגת על ידי החלפה של לב על כל צעד של ° 10 עם מצלמה דיגיטלית קבוע במיקום של כף יד אחת.
9. קח את הלב מתוך החדר. מסננים את כל הפתרונות. לשטוף את מערכת זלוף ברצף של די מים, אלכוהול מגיב 70%, ושוב מים DI.
10. ניתוח הנתונים כולל שחזור של הגיאומטריה הלב מן 36 צילומים דיגיטליים, רישום של האות האופטי על פני השטח של הגיאומטריה המשוחזר, וכימות משך פוטנציאל פעולה (APD), מהירות ההולכה (CV), שלב וכו ^'6

4. ביצוע ניסויים באמצעות מערכת מיפוי כפול

1. (המשך אחרי חלק 2) מניחים את הלב cannulated בתא זכוכית (רדנוטי) ולחבר את הצינורית למערכת זלוף. הצמד את הלב לתחתית סיליקון של החדר בבית חדרית הקודקוד ואת הפרוזדורים.
2. כבה את האור בחדר. לאט לאט להזריק פתרון מניות blebbistatin (15 ~ 20 דקות להגיע 10μM) דרך יציאת זריקה לפני קנית זלוף לשתק את הלב.
3. מניחים צלחת פטרי מפלסטיק, או כיסוי אחר חלון זכוכית, מעל פני השטח epicardial כדי להפחית את התנועה של פני השטח את הפתרון.
4. פוקוס שתי מצלמות CMOS במערכת מיפוי כפול (Ultima-L, SciMedia) בשדה באותו מבט. הקרינה הנפלטת מופרד באמצעות מראה dichroic (635nm החיתוך, אומגה אופטי), ו מסוננים לפי longpass מסנן 700nm (Thorlabs) עבור אותות מתח על ידי bandpass 590/30 ננומטר המסנן (אומגה אופטי) עבור אותות סידן.
5. מטרת המדריכים לאור שתי מנורות הלוגן (Newport אוריאל מכשירים, סטרטפורד, CT, SciMedia, בקוסטה מסה, קליפורניה) לכיוון שדה ומיפוי של נוף להשיג אפילו תאורה. מסננים עירור (531/40 ננומטר, SemRock) משמשים.
6. הכתם הלב עם הפתרון מתח רגיש לצבוע 237 מניות RH (10 ~ 30 μL) דרך יציאת ההזרקה.
7. מערבבים את Rhod, 02:00 (0.2mL) פתרון מניות עם Pluronic F-127 (Invitrogen, 01:01 תערובת). Sonicate עבור 1min ב sonicator מים באמבטיה. להזריק את התערובת דרך נמל הצייד של בועה. המתן כ 20 דקות כדי לאפשר את דה esterification של Rhod-02:00 לפני תחילת המיפוי.
8. להקלטת אחד, לכבות את משאבת superfusion כדי למנוע תנועה על פני השטח של הפתרון: להפעיל עירור מקור אור (מנורות הלוגן); לקחת הקלטות אופטי באמצעות שתי מצלמות מחובר למערכת רכישת נתונים (Ultima-L, SciMedia) , לכבות את האור עירור, ולהדליק את המשאבה superfusion. בדוק את האיכות של אותות אופטיים. מחדש את רקמת הכתם במידת הצורך.
9. סיום שאר פרוטוקול הניסוי מיועד למחקר.
10. כבה את האור בחדר וגם לצלם הלב המכיל את שדה הראיה. קח את הלב מתוך החדר. מסננים את כל הפתרונות. לשטוף את מערכת זלוף ברצף של די מים, אלכוהול מגיב 70% (פישר סיינטיפיק), ומים DI.
11. ניתוח הנתונים כולל מדידות של APD, קורות חיים, משך סידן חולף (CaTD), העיכוב בין upstroke AP ועליית חתול, זמן עלייה של סידן החולף, וזמן מתמיד של התאמה monoexponential של ריקבון החתול.

נציג תוצאות:

באיור 1. תוצאות הניסוי נציג Langendorff-perfused ארנב באמצעות מערכת מיפוי אופטי פנורמי. (א) להציג הקדמי של הלב שפן ואת הגיאומטריה משוחזר לב ארנב בצורת משטח רשת, רשת תלת מימדי. (ב) Tהוא הסיר משטח epicardial בצבעים ידי השלב (המתקבלים מתוך ניתוח השלב מטוס ¹⁸⁾ המציין את Wavefront באדום במהלך אפיזודה של tachyarrhythmia. (ג) פוטנציאל אופטי פעולה הקלטות מחמישה מיקומים ברחבי הייחודיות השלב התאפיינה 1-5 בלוח ב (ד) שמונה תמונות של Wavefront ההפעלה (צבע אדום) התפשטות במהלך מחזור של הפרעות קצב ההולך ושב יציב. חוגים Wavefront בכיוון השעון סביב הייחודיות שלב, הגלוי על פני השטח הקדמי של הלב. הצבע עבור repolarization (כחול) מוגדרת להיות שקוף חלקית כך Wavefront האחורי גלוי (למשל, על 80ms, 100ms, 120ms ו). הסרט של הפרעת קצב זו ההולך ושב מסופק וידאו משלים 1. השיטות לשחזור הגיאומטריה, רישום סימן, החישוב של המפה שלב, ואת הסרת פני השטח מתוארות פרטים במקום אחר ^6.

איור 2. תוצאות נציגת ניסוי Langendorff-perfused ארנב לב באמצעות מערכת מיפוי כפול (מיפוי סימולטני של פוטנציאל פעולה וסידן חולף). (א) המשטח הקדמי של הלב עם השדה מיפוי מבט מכוסה על ידי נקודות שחורות. (ב) להציג תקריב של הקלטות מאתר אחד. (ג) עקבות מדגם של פוטנציאל פעולה (כחול) וסידן חולף (אדום) של מערך של מיקומים מחולקת באופן שווה מסומן על ידי נקודות שחורות ב הערה א הפאנל כי לא כל ההקלטות פיקסל מוצגים ואת ברזולוציה מרחבית היא 200μm.

דיון

בהתבסס על הניסיון שלנו, את המפתחות על ניסוי מוצלח לב Langendorff-perfused ארנב כוללים פתרון מוכן היטב "Tyrodes, הקציר מהירה של הלב, מתוחזק היטב בלחץ זלוף, ו-pH מתאים הפתרון מחומצן במערכת זלוף. כדי להקליט את האות עם היחס הגבוה ביותר אות לרעש אפשרי, אנחנו צריכים לשקול גורמים שונים, לרבות מקור אור, מסננים אופטיים, תוך התמקדות אופטיקה, photodetectors, וכו ^'19. פרטים על היבטים אלה הם דנו במקום אחר ^19. ארנבים צעירים (גיל: 4-5 חודשים, משקל: 7-9 ק"ג) יכול לשמש כדי למנוע את השומן epicardial, אשר מקטין את יחס אות לרעש של אותות אופטיים.

האות נרשמו על ידי כל פיקסל הוא שילוב משוקלל של האור הנפלט בהיקף של רקמות. עומק נפח רקמה זו תלויה באורכי גל עירור ופליטה של ​​צבע המשמש. עבור di-4-ANEPPS, כדוגמה, את עומק החדירה הוא מוערך 300μm בלב ארנב ^20. לכן, הפירוש של האות האופטי צריך להיעשות בזהירות כאשר ההטרוגניות המקומי של הפונקציה חשמל נמצאים sinoatrial הצומת, הצומת החדרים והעליות, ובמהלך הפרעת קצב חדרית ^1,21,22.

מגבלה אחת של טכניקת מיפוי אופטי לעומת הקלטה אלקטרודה היא כי השלב repolarization של פוטנציאל הפעולה אופטי distored לעתים קרובות על ידי חפץ תנועה נגרמת על ידי התכווצות הלב. אילוץ מכני יכול לשמש כדי להפחית את החפץ, אך לא ניתן לבטל לחלוטין את זה. לשם השוואה, פרמקולוגיות, עירור והתכווצות uncouplers יעילים בהסרת חפץ בתנועה. עם זאת, אלה uncouplers (למשל 2,3-Butanedione Monoxime) יכול להיות משמעותי תופעות לוואי אלקטרו. Blebbistatin הודגם כי אין תופעות לוואי על electrophysiology הלב בלב נורמלי ^23, ובכך הוא מבטיח uncoupler למיפוי אופטי. יצוין כי את התאוצה של בצקת עקב ביטול של התכווצות יכול להשפיע גם על electrophysiology.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
מגיב	חברה	מספר קטלוגי
NaCl	פישר סיינטיפיק, הדשא הוגן, ניו ג'רזי	S271-1
CaCl 2 (2H 2 O)	פישר סיינטיפיק, הדשא הוגן, ניו ג'רזי	C79-500
KCl	פישר סיינטיפיק, הדשא הוגן, ניו ג'רזי	S217-500
MgCl 2 (6 שעות 2 O)	פישר סיינטיפיק, הדשא הוגן, ניו ג'רזי	M33-500
לאא 2 PO 4 (H 2 O)	פישר סיינטיפיק, הדשא הוגן, ניו ג'רזי	S369-500
NaHCO 3	פישר סיינטיפיק, הדשא הוגן, ניו ג'רזי	S233-3
D-גלוקוז	פישר סיינטיפיק, הדשא הוגן, ניו ג'רזי	D16-1
Blebbistatin	Tocris Bioscience, Ellisville, MO	1760
Di-4-ANEPPS	Invitrogen, בקרלסבד, קליפורניה	D1199
RH237	Invitrogen, בקרלסבד, קליפורניה	S1109
Rhod, 02:00	Invitrogen, בקרלסבד, קליפורניה	R1244
Pluronic F127	Invitrogen, בקרלסבד, קליפורניה	P3000MP
Sulphoxide דימתיל (DMSO)	סיגמא, סנט לואיס, מיזורי	D2650