כניסת השפעה להערכת התכונות המכניות של רקמת מוח של עכבר

תקציר

מקור: Canovic, E. P., et. al., אפיון תכונות מכניות רב-ממדיות של רקמת המוח באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי, הזחת פגיעה וריאומטריה. J. Vis. Exp. (2016)

הסרטון מדגים שימוש בהזחת פגיעה כדי למדוד את התכונות המכניות של רקמת מוח של עכבר מיובש, כולל נוקשות, פיזור אנרגיה ושיכוך, באמצעות תזוזה של בדיקה וניתוח מהירות.

פרוטוקול

כל ההליכים הכוללים דגימות של בעלי חיים נבדקו ואושרו על ידי ועדת הביקורת האתית המתאימה לבעלי חיים.

1. הזחת השפעה
   1. כייל את הננו-אינדינטר המכשירים והתאם את הגדרות ברירת המחדל כדי לאפשר ניסויי השפעה דינמיים על רקמות מוח מיובשות בהתאם להוראות היצרן.
      1. הרכיב בדיקה כדורית על ידי החלקתה על המטוטלת באמצעות פינצטה.
      2. הדביקו דגימת קוורץ התמזגה על עמוד הדגימה, המוברג לשלב התרגום.
      3. עבור לתפריט כיול ובחר "תא נוזלי". עקוב אחר הוראות התוכנה כדי ליצור קשר עם הקוורץ הממוזגtagamp.
      4. בחר "רגיל" עבור סוג Indenter והשתמש בערך ברירת המחדל של 0.05 mN עבור עומס Indenter. לחץ על "המשך" כדי לבצע את הכיול עבור תצורת הכניסה הרגילה.
      5. הזז את שלב הדגימה לאחור ב-5 מ"מ לפחות. התקן את זרוע המנוף, המאפשרת להוריד את הגשושית לתוך התא הנוזלי, וחזור על כיול התא הנוזלי בתצורה החדשה על ידי בחירה ב"תא נוזלי" עבור סוג Indenter. לחץ על "המשך" כדי להשיג את גורם כיול התא הנוזלי.
      6. הפעל את אפשרות התוכנה Liquid Cell על ידי מעבר לתפריט הניסוי ובחירה באפשרות "אפשרויות מיוחדות". השתמש בערך הכיול העדכני ביותר.
      7. הגדל את מרווח לוחות הקבלים, מכיוון שהדבר יוביל לעומק מדיד מקסימלי גדול יותר, הכרחי בעת בדיקת חומרים תואמים מאוד.
         1. בתפריט מערכת, בחר "הגדרות לא מוגנות" ו"פרמטרי מכונה" כדי לשנות את קצב העומס של בדיקת המטוטלת, קצב העומס האפס והיסט רמפת ההמתנה ל-0.5 mN/sec, 0.1 mN/sec ו-3 V, בהתאמה.
         2. בעזרת מפתח ברגים, סובב את שלושת האומים השולטים במרווח לוחית הקבל בכיוון השעון במרווחים קטנים.
         3. לאחר כל סיבוב מלא בכיוון השעון, בחר "התאמת תיבת גשר" בתפריט תחזוקה וקבל בדיקת מטוטלת טובה, אשר תדרוש הזזת משקל האיזון הנגדי הרחק מהמטוטלת.
         4. חזור על שלבים 1.1.7.2-1.1.7.3 עד שכיול העומק המשוער יקרא ערך של 70,000 ננומטר/וולט ומעלה.
      8. מקם עצירת גבול חדשה בתחתית המטוטלת הניתנת להפעלה וכיבוי באמצעות ספק כוח. החזר את עצירת הגבול המקורית היושבת מאחורי המטוטלת כדי להסיר חסימה פוטנציאלית של תנועת המטוטלת ולאפשר מהירויות פגיעה גבוהות יותר כמו גם עומק חדירה גבוה יותר לדגימות תואמות.
      9. אפשר לארון להגיע לשיווי משקל תרמי (לוקח כשעה).
      10. בזמן שהארון מתאזן, חזור לתפריט המערכת ובחר "הגדרות לא מוגנות" ו"פרמטרים של מכונה". הגדר את מהירות המגע של כיול העומק (dcal) ל-1 מיקרומטר/שנייה, את מהירות מגע הכניסה העיקרית ל-3 מיקרומטר/שנייה, ואת מהירות מגע העומס הנמוכה במיוחד ל-1 מיקרומטר/שנייה.
      11. תחת תפריט כיול, בצע כיול עומק סטנדרטי בתצורה חדשה זו.
      12. הפעל את ספק הכוח לסולנואיד והגדר אותו ל -10 וולט. עבור לתפריט הניסוי ובחר "השפעה" ו"התאם תזוזה דחף". עקוב אחר הוראות התוכנה (הנחיות אוטומטיות) כדי לכייל את מרחק הנדנדה של המטוטלת.
2. הרכיבו את רקמת המוח של העכבר בתא הנוזלי.
   1. לאחר קצירת המוח כולו, אחסן אותו מיד במדיום תזונתי בלתי תלוי ב-CO₂ עבור מדיה של רקמות עצביות בוגרות על קרח.
   2. כאשר הגדרת הזחת ההשפעה הושלמה במלואה, העבירו בזהירות את המוח לצלחת פטרי יחד עם תווך בלתי תלוי ב-CO₂. חתכו את המוח למקטעים בעובי 6 מ"מ עם משטחים שטוחים משני הצדדים.
   3. הדביקו את הרקמה הפרוסה לעמוד דגימת האלומיניום בשכבה דקה של דבק ציאנואקרילט.
   4. החלק את התא הנוזלי מעל טבעת ה-O השנייה בעמוד הדגימה, ומלא את התא הנוזלי ב-5 מ"ל של מדיום בלתי תלוי ב-CO₂ כדי לטבול את הרקמה במלואה. לאחר מכן, עמוד לדוגמה זה מותקן בזהירות על שלב התרגום בתוך הננו-מתקן המכשיר.
3. מדוד את תגובת ההשפעה של רקמת המוח.
   1. במידת הצורך, הסר את הגשושית הכדורית והחלף אותה בבדיקה המעניינת מבלי להסיר את זרוע המנוף.
   2. בתפריט מערכת, בחר "הגדרות לא מוגנות" ו"פרמטרים של מכונה". שנה את מהירות מגע הפגיעה העיקרית ל-5 מיקרומטר/שנייה.
   3. כאשר אמבט הדגימה נמוך (-z-direction) ורחוק מהמטוטלת (כיוון +x), זז בכיוון -x עד שקצה זרוע הידית ממוקם כראוי מעל האמבטיה. זז בכיוון +z עד שהקצה שקוע במלואו באמבטיה ומול הדגימה.
   4. באמצעות חלון בקרת שלב הדגימה, צור קשר בזהירות ולאחר מכן החזר את השלב הרחק משטח הדגימה בכ-30 מיקרומטר.
   5. תחת תפריט הניסוי, לחץ על "השפעה" כדי להגדיר ניסוי השפעה. בחר עומס דחף ספציפי שיתייחס ישירות למהירות הפגיעה המתקבלת בהתבסס על כיול מרחק הנדנדה. הפעל את הניסוי המתוזמן.
   6. כאשר המטוטלת נעה לאחור, ומשטח הדגימה ממשיך לנוע למישור המדידה, כבה את מתג עצירת הגבול התחתון.
   7. התבונן כיצד המטוטלת נעה קדימה כדי להשפיע על הדגימה. תזוזה של הגשושית כפונקציה של זמן תירשם על ידי התוכנה.
   8. כאשר חלון xyz stage מופיע, הפעל שוב את מתג עצירת הגבול.
   9. חזור על שלבים 3.4-3.8 כדי לבדוק כמה עומסים ומיקומים שונים לפי הצורך.
4. נתח את תגובת התזוזה הנרכשת לעומת הזמן של המטוטלת באמצעות סקריפטים מותאמים אישית של MATLAB כדי לקבוע את עומק החדירה המרבי xmax, קיבולת פיזור האנרגיה K וגורם איכות הפיזור Q.
   1. עבור לתפריט ניתוח וייצא את הנתונים בקובץ טקסט.
   2. קח את נגזרת הזמן של פרופיל התזוזה כדי לקבל מהירות כפונקציה של זמן. הגדר אפס תזוזה כנקודת המגע xo1.
      הערה: מהירות הפגיעה vin היא המהירות המקסימלית מיד לפני המגע. xmax מתאים לעיוות שבו מהירות הגשושית יורדת תחילה לאפס. xo2, המקביל ל-xr, הוא המיקום הנדרש כדי להתחיל מחדש מגע עם הדגימה המעוותת במחזור הבא. מהירות ריבאונד v החוצה היא המהירות בתזוזה xr.
   3. } הגדר K (ללא יחידה) כאנרגיה המתפזרת על ידי הדגימה המנורמלת על ידי סכום אנרגיות הדגימה המוחזרות והמתפזרות במהלך מחזור הפגיעה הראשון. חשב K על סמך התכונות הפנימיות של המטוטלת (כגון קשיחות סיבובית ומקדם שיכוך), xo1, xmax, xr, vin, ו-vהחוצה.
   4. מכיוון שניתן לתאר תזוזה כתנועה הרמונית מעוכבת, התאימו פונקציית דעיכה מעריכית למקסימום של עקומת התזוזה לעומת הזמן.
   5. חשב את Q (ללא יחידה) π כפול מספר המחזורים הנדרשים כדי שמשרעת התנודה תפחת בפקטור של e. ערך Q גבוה יותר פירושו קצב פיזור אנרגיה נמוך יותר.

חומרים