מדידת התכונות הויסקו-אלסטיות של רקמת מוח של עכבר באמצעות ראומטריה

תקציר

מקור: Canovic, E. P., et al. אפיון תכונות מכניות רב-ממדיות של רקמת המוח באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי, הזחת פגיעה וריאומטריה. J. Vis. Exp. (2016)

בסרטון זה, נעשה שימוש בריאומטר כדי להחיל תנועה סיבובית תנודתית מבוקרת על רקמת המוח כדי ליצור מתח גזירה ולהעריך את התכונות הצמיגות והאלסטיות של הרקמה. הריאומטר, ככלי פונקציונלי, הוא מספק תובנות לגבי מכניקת המוח במהלך פציעה או מחלות ניווניות.

פרוטוקול

כל ההליכים הכוללים דגימות של בעלי חיים נבדקו ואושרו על ידי ועדת הביקורת האתית המתאימה לבעלי חיים.

1. ריאולוגיה
   1. הגדר וכייל את הראומטר לפי הוראות היצרן.
      1. אתחל את הריאומטר על ידי פתיחת המכשיר/לוח הבקרה. בכרטיסיית לוח הבקרה, לחץ על "אתחול".
      2. התקן את לוחית המדידה בקוטר 25 מ"מ (PP25) ואת המערכת התרמית.
      3. (אופציונלי) כדי להפחית החלקה בין לוחות הריאומטר לרקמה, גזרו פרוסות נייר זכוכית דביקות התואמות את צורת לוחית הריאומטר העליונה והדביקו את נייר הזכוכית לצלחת העליונה והתחתונה.
      4. צור קשר בין הלוחות העליונים והתחתונים על ידי לחיצה על "הגדר אפס פער" בלוח הבקרה.
      5. אפס את מתמר הכוח הרגיל על ידי לחיצה על "אפס כוח רגיל".
      6. בצע בדיקת אינרציה על ידי פתיחת לשונית השירות בלוח הבקרה, לחיצה על "מערכת מדידה" ולאחר מכן לחיצה על "בדיקת אינרציה". רשום את האינרציה הישנה והחדשה. ודא שהאינרציה נמצאת בגבול המותר עבור הבדיקה, כפי שמופיע על ידי היצרן.
2. טען את הדגימה לתוך הריאומטר.
   1. לאחר קצירת הרקמה וחיתוך מקטע עטרה של מוח החזיר לעובי של ~5 מ"מ, אחסן אותה על קרח בתווך שאינו תלוי ב-CO2.
   2. הניחו את המוח בין שתי הצלחות. הסר טיפות מים גדולות מהמשטח העליון והתחתון של הדגימה כדי למנוע החלקה, אך אל תייבש את הדגימה.
   3. הורד לאט את לוחית המדידה עד שהצלחת תהיה במגע מלא עם המשטח העליון של הרקמה והכוח הנורמלי הנמדד עקבי ב-0.01 mN לאחר תקופת הרפיה של 5-10 דקות.
      1. בלוח הבקרה, הזן גבהים נמוכים יותר ברציפות בתיבת מיקום המדידה ולחץ על "מיקום מדידה" כדי להוריד לאט את לוחית המדידה.
      2. כאשר נמצא במרחק של מילימטר ממגע עם הרקמה, הורד את לוחית המדידה במרווחים של 0.1 מ"מ עד שהצלחת תהיה במגע מלא עם המשטח העליון של הרקמה. ודא שהכוח הנמדד-נורמלי הוא באופן עקבי ב-0.01 mN לאחר תקופת הרפיה של 5-10 דקות.
      3. רשום את הכוח הנורמלי הראשוני שנמדד. יש לבצע מדידות חוזרות ונשנות באותם לחצים/מתחים דחיסה.
   4. אם הדגימה עולה על קוטר הצלחת, חתוך אותה בעזרת להב פלסטיק. פיפטה נפח קטן (~1-2 מ"ל) של מדיה בשולי הדגימה כדי להרטיב את הרקמה.
   5. (אופציונלי) הורד את מכסה המנוע התרמי. בלוח הבקרה, הגדר את הטמפרטורה ל-37 מעלות צלזיוס ולחץ על "הגדר".
3. בצע טאטא משרעת כדי לקבוע את הטווח הויסקו-אלסטי הליניארי של החומר ( כלומר, את זני הגזירה שבהם G' ו-G'' קבועים) בתדירות מעניינת ( למשל, 1 rad/sec).
   1. בחר "קובץ/חדש". תחת לשונית הג'ל, בחר "טאטא משרעת: טווח LVE". בחר חלון ולחץ על "מדידה 1: טאטא משרעת". לחץ פעמיים על תיבת התנודה. הזן את המתח ההתחלתי והסופי ( למשל, 0.01 עד 105), את התדירות ( למשל, 1 rad/sec), ואת מספר הנקודות לעשור ( למשל, 6 נקודות/דצמבר). בחר "אישור" ולחץ על "התחל".
   2. חזור על הליך זה עבור מספר פרוסות עם ניסיונות חוזרים ונשנים כדי להבטיח עקביות של הטווח האלסטי הליניארי. הדחיסה הצירית של הדגימה צריכה להישאר קבועה בין הדגימות.
4. בצע סריקת תדרים של הרקמה במתח בטווח הויסקו-אלסטי הליניארי של הרקמה ( למשל, 1% מתח), ובטווח תדרים מעניין ( למשל , 0.1-100 רד/שנייה).
   1. לחץ על "קובץ/חדש" ותחת לשונית הג'ל בחר "טאטא תדרים". לחץ על חלון/מדידה 1: טאטוא תדרים. לחץ פעמיים על תיבת התנודה. הזן את טווח התדרים ( למשל , 0.1 עד 100 רד/שנייה), את המתח ( למשל , מתח של 1%), ואת מספר הנקודות לעשור ( למשל , 6 נקודות/דצמבר). בחר "אישור" ולחץ על "התחל" כדי להתחיל את סריקת התדרים.
5. חזור על ניקוי תדרים (שלב 1.4) בשכפולים או במשולשות.

סקור את הנתונים המחושבים ומיוצאים באופן אוטומטי על ידי הריאומטר: G' ו- G" כפונקציה של תדר (סריקת תדרים) או מתח גזירה (טאטא משרעת). הערה: G' ו-G'' מחושבים ממשרעת המומנט הריאקציוני (המקסימלי) של הדגימה T'0, וזווית תזוזה סיבובית (או זווית סטייה) φ°, ופיגור פאזה φ, של תגובת המדגם למתח התנודה המופעל (איור 1):

כאשר R ו-h הם הרדיוס והגובה של הדגימה.

תוצאות

איור 1. איור של ניסויי ריאומטר צלחת מקבילים. (א) סכמטי של ניסוי ריאומטר צלחת מקבילה והגדרות הקשורות למתח גזירה תנודתי מיושם. (ב) מאמץ מופעל מייצג ולחץ כתוצאה מכך כפונקציה של זמן. מודול אחסון גזירה G' ומודול אובדן גזירה G" מחושבים באמצעות משרע...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
Xylaxine	Lloyd Laboratoried		perscription drug
Ketamine	AnaSed Injections		perscription
drug Hibernate-A Medium	Gibco	A1247501	CO2-dependent neural neural בינוני לרקמות
למבוגרים ריאומטר צלחת מקבילה MCR501	Anton-Parr	-
PP25	Anton-Parr-25		מ"מ קוטר לוחית מדידה שטוחה
נייר זכוכית דבק	McMaster-Carr	4184A48	ניתן להשתמש בספקים חלופיים
Loctite 4013 Instant	Adhesive Henkel	20268	ניתן להשתמש בספקים חלופיים