ספקטרומטריית פלזמה-מסה בשילוב אינדוקטיבי של אבלציה בלייזר להדמיית מתכות ברקמת מוח של עכבר

תקציר

מקור: Hare, D. J., et.al. הדמיית מתכות ברקמת המוח על ידי אבלציה בלייזר - פלזמה בצימוד אינדוקטיבי - ספקטרומטריית מסה (LA-ICP-MS). J. Vis. Exp. (2017)

סרטון זה מדגים את השימוש בספקטרומטריית פלזמה-מסה בצימוד אינדוקטיבי של אבלציה בלייזר (LA-ICP-MS) כדי להמחיש ולכמת התפלגות מתכות ברקמת מוח של עכבר. הפרוטוקול כולל אבלציה בלייזר ליצירת תרסיס של חלקיקי דגימה, יינון של החלקיקים בפלזמה בטמפרטורה גבוהה וספקטרומטריית מסה כדי להפריד את היונים לפי יחסי המסה למטען שלהם. לאחר מכן משתמשים בתוכנה מיוחדת ליצירת תמונות כמותיות, החושפות את ההתפלגות המרחבית של המתכות בתוך הרקמה.

פרוטוקול

כל ההליכים הכוללים דגימות של בעלי חיים נבדקו ואושרו על ידי ועדת הביקורת האתית המתאימה לבעלי חיים.

1. הכנת LA-ICP-MS לניתוח

1. מקם תקנים ודגימה בתא האבלציה, ומבטיח שהם נמצאים בעומק השדה של מצלמת ה-CCD המותקנת ביחידת LA. אם יש צורך בכוונון המכשיר, כלול חומר עזר מתאים (למשל, NIST 612 יסודות קורט בזכוכית). הדק באצבע את שני הברגים על דלת החדר כדי לאטום את תא האבלציה.
2. בתוכנת ICP-MS, בחר פתח את שסתום גז הארגון ב'תחזוקה' או בפאנל דומה והגדר את זרימת הגז המוביל ל-1.2 ליטר ^דקה-1 בתיבת הדו-שיח המתאימה.
   הערה: בפרוטוקול זה ארגון משמש כגז המוביל. מספר דוגמאות משתמשות בהליום או בתערובת של הליום וארגון כגז נשא.
3. בתוכנת LA, לחץ על כפתור 'טיהור' כדי לשטוף את התא בגז ארגון למשך 30 דקות לפחות.
   הערה: ניתן לשנות את זמן הטיהור על ידי לחיצה על 'זמן טיהור' או כפתור דומה. בעת שימוש במערכת אבלציה עם תא אבלציה דו-נפחי, העבר מעת לעת את הבמה לכל פינה וחצה את התא באלכסון כדי להבטיח שכמה שיותר אוויר שיורי יוסר מהתא. ניתן להשיג זאת על ידי בחירת 'שלבי הבית' או פונקציה מקבילה.
4. הפעל את ה- ICP-MS על ידי לחיצה על 'פלזמה מופעלת' ואפשר להתחמם למשך שעתיים, במהלכן ניתן לבצע שלבים 1.5 - 2.4. הגדרות המכשיר משתנות בין היצרנים.
5. אבלציה מייצגת של תקני רקמות
   1. בחר בכלי הקו וצייר קו אבלציה בודד באורך של כ-3 מ"מ על פני הרקמה.
   2. הגדר את הפרמטרים באופן הבא על ידי לחיצה ימנית על קו האבלציה ברשימת הניסויים ושינוי הדברים הבאים: קוטר אלומה (נבחר לפי הצורך על ידי המשתמש; כאן משתמשים בקרן מרובעת של 30 מיקרומטר), מהירות סריקה (פי 4 מקוטר האלומה לשנייה; 120 מיקרומטר לשנייה) ושטף אנרגיה (0.3 -0.5 J ^cm-2 לרקמות רכות; אופטימיזציה במידת הצורך למטריצות קשות יותר). בעובי רקמה של 30 מיקרומטר קרן הלייזר אינה חודרת לעובי המלא של רקמה זו, ומבטלת כל מזהם פוטנציאלי מתמיכת המיקרוסקופ. ניתן להשתמש בנורמליזציה לפחמן כדי לתקן את השונות בכמות הרקמה שנכרתה. הגדר פרמטרים אלה כברירת מחדל עבור כל שורה עוקבת על ידי בחירה בלחצן הבחירה 'ברירת מחדל'.
   3. שכפל את השורה הזו שש פעמים על ידי בחירת השורה הראשונית, לחיצה ימנית ובחירה ב'סריקות כפולות'. ודא שהקווים מתקזזים בציר ה-x או ה-y בקוטר האלומה. זה נותן בסך הכל שבעה קווים לכל תקן, המרוחקים זה מזה בהתאם לקוטר האלומה.
   4. חזור על שלבים 1.5.1 - 1.5.3 עבור כל תקן, תוך הבטחת הקו באורך זהה.
6. כדי לצייר את אזור האבלציה מעל הדגימה, בצע אחת משתי השיטות הבאות:
   הערה: ודא שאותם פרמטרי סריקה (קוטר קרן, מהירות סריקה, שטף אנרגיה) משמשים עבור קווי דגימה.
   1. אם מערכת LA מצוידת בשדה ראייה רחב, בחר בכלי הקו וצייר קו מהפינה השמאלית העליונה של המדגם מספיק זמן כדי לכסות את הדגימה בנקודה הרחבה ביותר שלה באמצעות אותם פרמטרי לייזר המתוארים ב-1.5. שכפל סריקה זו כמתואר ב-1.5.3 עם קווים מרווחים בהתאם לקוטר האלומה כמה פעמים שצריך כדי להבטיח כיסוי מלא של הדגימה.
   2. אם שדה רחב view אינו זמין, קבע ורשום את קואורדינטות x ו-y (המוצגות בדרך כלל במסך הראשי כ'מיקום במה' או דומה) המתאימות לפינות של מלבן המכסה את כל הדגימה. השתמש בקואורדינטות אלה כדי למקם קווי אבלציה מקבילים המכסים את כל שטח הדגימה.
   3. שרטט קווים לסריקה לסירוגין של תקנים לכל המאוחר לאחר ~20 שעות של סריקת הדגימה על ידי חזרה על התהליך המתואר ב-1.5. בהתאם למשך הסריקה של הדגימה, ייתכן שיידרש מספר פעמים. סיים את הניסוי בסריקה נוספת של התקנים.
      הערה: בעת קביעת קואורדינטות x ו-y בזמן טיהור התא, בחירת מיקומי הבית והכיול הנלווה של הציר ישנו את הפרטים שנרכשו בעבר עבור קואורדינטות x ו-y ואילו ההבדל (כלומר אורך הקו) לא יושפע.

2. הגדרת שיטות רכישת נתונים עבור ה-ICP-MS

1. עבור קו האבלציה הסטנדרטי, חלקו את אורך הקו במהירות סריקת הלייזר כדי לקבוע את זמן הניתוח הכולל עבור קו בודד. חזור על פעולה זו עבור שורת הדוגמה.
2. בתוכנת ICP-MS, צור שיטה חדשה (מוצגת כאן כ'אצווה') וודא שנבחר 'ניתוח שנפתר בזמן' או שווה ערך. בחר את ערכי m/z שיש לזהות, ולאחר מכן התאם את זמן האינטגרציה עבור כל m/z כך שזמן האינטגרציה הכולל למחזור אחד שווה ל-0.25 שניות. לחץ על 'שמור אצווה בשם' ושם בהתאם (למשל, Std1).
   הערה: מכיוון שהדגימה תחצה את קרן הלייזר פי ארבעה מקוטר האלומה, הדבר מבטיח שנקודת נתונים עבור כל מסה נרשמת שווה לקוטר הקרן. לדוגמה, באמצעות גודל נקודה של 100 מיקרומטר, מהירות סריקה של 400 מיקרומטר ^לשנייה עם זמן אינטגרציה של 0.25 שניות תפיק תמונות עם גדלי פיקסלים אמיתיים. ניתן להתאים את זמן האינטגרציה כדי לשפר את הרגישות; בעת הגדלת זמן האינטגרציה ל-0.33 שניות, יש להאט את מהירות הסריקה פי שלושה מקוטר האלומה.
3. לתקנים, הזן את זמן הניתוח עבור כל סריקת קו בתיבה המתאימה, בתוספת 15 שניות נוספות כדי לקחת בחשבון את זמני החימום והשטיפה של הלייזר. הזן רשימת הפעלה לדוגמה (כלומר הסדר שבו סריקות מופעלות) עם אותו מספר רכישות (בדרך כלל ממוספרות ברצף; כלומר 001, 002 וכו') כמספר הכולל של קווים סטנדרטיים.
4. עבור המדגם, שכפל את השיטה המשמשת לתקנים על ידי שמירת השיטה או האצווה הנוכחית עם שם קובץ חלופי, והתאם את זמן הרכישה הכולל (כולל 15 השניות הנוספות) ואת המספר הכולל של הרכישות כך שיתאימו למספר השורות שיבטלו את הדגימה.
   הערה: מכיוון שרוב מערכות LA-ICP-MS משתמשות בטריגר חד-כיווני (LA מפעיל ICP-MS), חיוני שתוכנת ICP-MS תמתין לטריגר מלוס אנג'לס לפני תחילת קו האבלציה הבא. בחלון הרכישה של ICP-MS יהיה כתוב 'ממתין להתחלה'.

3. הפעלת הניסוי

1. הפעל את תור ICP-MS על ידי הוספת השיטה או האצווה הראשונה לתור וודא שהתוכנה ממתינה לטריגר ממערכת LA.
2. בתוכנת LA, הפעל את ספק הכוח של הלייזר על ידי לחיצה על 'פליטה', לחץ על 'הפעל' והגדר את זמן חימום הלייזר ל-10 שניות ואת זמן השטיפה ל-20 שניות בתיבות המתאימות.
   הערה: הצפה זו תבטיח שה-ICP-MS מוכן להתחיל לרכוש נתונים חדשים כאשר הלייזר יתחיל בכל קו אבלציה שלאחר מכן.
3. התחל את רצף הלייזר על ידי לחיצה על 'התחל'. אם אתה משתמש בתא בעל שני נפחים, ודא שכוס הדגימה נמצאת במקומה.

4. חישוב תקני כימות

הערה: ישנן וריאציות מרובות להמרת נתוני ICP-MS לתמונות. אלה כוללים שימוש בכלי תוכנה תוצרת בית הכתובים בשפות קוד פתוח, פקודות מאקרו מסחריות ותוכנות לניתוח נתונים. כאן, השתמש בתוסף התוכנה שפותח לאחרונה, המבוסס על חבילת ניתוח נתונים מיוחדת LA-ICP-MS.

1. העבר את כל תיקיות האצווה המכילות את נתוני ההפעלה (001.d, 002.d וכו') למחשב נפרד עם תוכנת הניתוח מותקנת. חלץ את קבצי הנתונים *.csv עבור כל שורה באצווה לתיקייה נפרדת.
   הערה: מומלץ מאוד להשתמש בסקריפט להעברה אוטומטית של *.csv קבצים לתיקייה חדשה. ראה קוד Python מצורף לפרטים נוספים. סקריפט זה נכתב כך שיתאים ל-ICP-MS מסדרת Agilent 7700 או 8800, אך ניתן לערוך אותו כך שיתאים לקובץ הפלט של יצרנים אחרים.
2. פתח את פלטפורמת התוכנה ופעל לפי הכרטיסיות ברצף כדי לייבא ולנתח את התקנים כדי לייצר תמונות כמותיות כמתואר להלן.
3. כדי לייבא את הנתונים מהאצווה הסטנדרטית הראשונה, בחר 'Agilent .csv' עבור 'סוג קובץ', 'תיקייה שלמה' עבור 'סוג ייבוא' ובדוק ש'פורמט התאריך' זהה לפורמט המחשב. לחץ על 'ייבוא', בחר את התיקיה המכילה את קבצי .csv עבור סט התקנים הראשון, ועבור לכרטיסייה 'קווי בסיס'.
4. חיסור בסיסי
   1. השתמש בכרטיסייה 'בחירות אוטומטיות' (פקודה 2) מהתפריט הנפתח הראשי של היישום בסרגל הכלים, בחר 'מידע מייבוא' ולחץ על 'המשך'.
   2. לחץ על 'בחר הכל' ובחר 'Baseline_1' לאינטגרציה.
   3. כדי לבחור את 10 השניות הראשונות של כל קו סריקה (המתאים לזמן חימום הלייזר), חתוך את הנתונים על ידי הזנת הערכים השניים '0' ו'(משך הקו - 10 שניות)' ולחץ על 'הוסף אינטגרציות' (למשל, עבור קו סריקה של 35 שניות, הזן את הערכים '0' ו-'25').
5. כדי לבחור את הנתונים לדוגמה, השתמש בכרטיסייה 'בחירות אוטומטיות' כמתואר בסעיף 4.4, אך בחר 'Output_1' כאינטגרציה. חתוך נתונים מההתחלה והסוף של כל שורה סטנדרטית כדי לא לכלול את אות הרקע (לדוגמה, עבור קו סריקה של 35 שניות, הזן את הערכים '13' ו-'4').
6. כדי לא לכלול נפילות באות הנגרמות על ידי חורים אפשריים בתקנים, בכרטיסייה 'דוגמאות', לחץ על 'ערוצים' בפינה השמאלית העליונה של אזור הגרף כדי לבחור ערוץ עם יחס אות לרעש גבוה (למשל, C13 או P31). רשום לעצמך כל ירידה חדה באות ובחר ערך CPS נמוך מספיק שהוא מתחת לשונות הרגילה בתוך הדגימות, אך גבוה מספיק כדי לזהות את הירידות החדות באות.
7. לחץ על הכרטיסייה 'DRS' ובחר 'Baseline_Subtract' עבור 'תוכנית הפחתת הנתונים הנוכחית'. בחר את הערוץ מ-4.6 עבור 'ערוץ אינדקס' ואת ערך ה-CPS עבור 'סף לשימוש בעת מיסוך אותות נמוכים'. הכנס ערך <0.5 שניות עבור 'שניות לחיתוך לפני/אחרי אותות נמוכים' כדי להסביר את העיכוב בהעברת האותות מהלייזר ל-ICP-MS.
8. כדי לאשר מיסוך הולם של אזורי האות הנמוך, לחץ בחזרה לכרטיסייה 'דוגמאות' ובחר מעקב אחר ערוצים מעובד (למשל, Fe56_CPS). חזור ומקד את ערכי ה-CPS ו-'שניות לחיתוך לפני/אחרי אותות נמוכים' כמו ב-4.7 במידת הצורך.
9. לחץ על הכרטיסייה 'תוצאות' ובחר 'ייצוא נתונים' מהתפריט הנפתח הראשי של האפליקציה. הזן שם קובץ כדי ליצור קובץ נתונים של גיליון אלקטרוני של התוצאות (למשל, חישובי Std1, Std2...).
10. פתח את קובץ הנתונים בתוכנית גיליון אלקטרוני מתאימה וחשב את ערכי ה-CPS עבור כל ערוץ בודד שיש לכמת. השתמש בריכוזי המתכות שנקבעו מראש מערפול התמיסה ICP-MS כדי לחשב את גורם ההמרה מערכי CPS ל-ppm (μg g⁻¹) עבור כל אלמנט הניתן לכימות.
11. חזור על שלבים 4.3 - 4.10 עבור כל ערכות התקנים בריצה.

5. בניית תמונות כמותיות

1. כתוב 'Biolite()' בשורת הפקודה כדי לפתוח את התוכנה.
2. ייבא את הנתונים לדוגמה על ידי לחיצה על 'טען תמונות' ובחירת התיקיה המכילה את .csv הקבצים עבור התמונה לדוגמה.
3. תיקון רקע
   1. לחץ על הכרטיסייה 'קווי בסיס' כדי להחיל תיקון רקע על הדוגמה. בתמונת הזרחן (P31) המוצגת על המסך, בחר אזורים ברקע באמצעות כלי ציור המלבן. בחירת אזורים רבים ככל האפשר יוצרת מפה כלל-תמונה של סחף אותות/פלזמה כדי להבטיח קיזוז הולם מהגורמים המבלבלים הללו.
   2. כדי להפוך את אות הרקע לגלוי יותר, בחר בכלי עריכת הגרפים (השמאלי העליון של התמונה המוצגת) ולחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על התמונה. בחר 'שנה מראה תמונה' ושנה את 'צבע ראשון ב-Z=' לערך שלילי גדול (למשל -100,000). המשך על ידי לחיצה על 'סיום'.
4. לחץ על הכרטיסייה 'תקנים' כדי להעלות טבלה של גורמי תיקון CPS/ppm . הזן ערכים המחושבים מהתקנים בשלב 4.10 עבור כל אחד מהאלמנטים. שלב זה יעזור לתקן את סחף הרגישות ב-ICP-MS. לחץ על 'צא!'
5. פתח את 'דפדפן נתונים' מלשונית 'נתונים', המכילה את התמונות עבור כל אלמנט וכל שלב.
6. כדי לסיים תמונה לייצוא, בחר את התמונה הרצויה בתיקייה 'StdCorrImages', לחץ לחיצה ימנית על שם התמונה (*_ppm) ולחץ על 'NewImage'. לחץ לחיצה ימנית על התמונה כדי לפתוח את 'שנה מראה תמונה' כדי לבחור טבלת צבעים וסרגל צבעים רצויים. הוסף סרגל צבעים לתמונה על ידי לחיצה ימנית על התמונה ובחירה ב'הוסף הערה'. בחר 'ColorScale' מהתפריט הנפתח השמאלי העליון והשתמש בכרטיסיות כדי לשנות את סולם הצבעים הרצוי.
7. כדי לייצא תמונה, ודא שהתמונה המדוברת נבחרה ונווט לכרטיסייה 'קובץ' ולחץ על 'שמור גרפיקה...'. בחר את הפורמט הרצוי ושמור את התמונה. לחלופין, ניתן להעביר את התמונה שנבחרה באמצעות כלי ההעתקה וההדבקה.
8. חזור על שלבים 5.6 ו- 5.7 עבור כל התמונות המעניינות.
9. כימות אזורים בדידים
   1. כדי להפעיל את כלי ההחזר על ההשקעה, נווט אל הכרטיסייה 'ניתוח', 'חבילות' ובחר 'עיבוד תמונה'.
   2. בחר את התמונה הרצויה ונווט לכרטיסייה 'תמונה' ולחץ על 'החזר ROI...'. לחץ על 'התחל ציור ROI' והשתמש בכלי ציור כדי לבחור אזור עניין במדגם. כדי לסיים את השרטוט, לחץ על 'סיים החזר ROI'.
   3. כדי לקבל את הנתונים הסטטיסטיים עבור החזר ה-ROI שנבחר, נווט לכרטיסייה 'תמונה' ולחץ על 'סטטיסטיקות...'.
   4. העתק והדבק את התוצאות בגיליון אלקטרוני נפרד. חזור על בחירת החזר ההשקעה (5.9.2) עבור כל האזורים והאלמנטים המעניינים.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
שקופיות מיקרוסקופ זכוכית סודה	n/a	n/a	שקופיות טיפוסיות מתאימות לכל הניסויים
NWR213 מערכת אבלציה בלייזר	}ESI Ltd	n/a	בשימוש בניסויים אלה. יצרנים אחרים מתאימים, עשויים לדרוש שינויים בפרוטוקול
Agilent 8800 Series ICP-MS	}Agilent Technologies	n/a	בשימוש בניסויים אלה. יצרנים אחרים מתאימים, עשויים לדרוש שינויים בפרוטוקול
Iolite	Iolite Software	n/a	זמין http://iolite-software.com/. שיטות אחרות זמינות, ראה פרוטוקול
}Excel	Microsoft	n/a
IGOR Pro	מדדי גלים	n/a	ניתן להפעלה מ https://www.wavemetrics.com/products/igorpro/igorpro.htm

}