הדמיית ביולומינסנציה להערכת צמיחת גידול בפרוסת מוח אורגנוטיפית של עכבר

תקציר

מקור: Ciraku, L., et. al. מודל פרוסת מוח ex vivo לחקר ומיקוד צמיחת גידול גרורתי במוח של סרטן השד. J. Vis. exp. (2021).

סרטון זה מדגים את ההדמיה של תאי גידול המבטאים לוציפראז בפרוסת מוח של עכבר אורגנוטיפי. לוציפרין מתווסף למדיום, והצלחת ממוקמת בתוך החדר של מערכת ההדמיה in vivo. פרמטרים ללכידת תמונה מותאמים, וצורת הגידול וגודלו מוגדרים. לאחר מכן נרשמים האותות הביולוגיים הנפלטים מתאי הגידול.

פרוטוקול

כל ההליכים הכוללים דגימות של בעלי חיים נבדקו ואושרו על ידי ועדת הביקורת האתית המתאימה לבעלי חיים.

הערה: במחקר זה נעשה שימוש בעכברים נקבות אתימיות Nu/Nu (בגילאי 6-8 שבועות).

1. הזרקה תוך גולגולתית של תאי גידול

1. עקר את כל הציוד (פינצטה, מספריים, מספריים לתפירה, מקדחה ידנית) במחזור יבש של חיטוי עד 45 דקות בשקיות עיקור, כולל מחוון עיקור. אם מבוצעים ניתוחים במספר בעלי חיים, יש לעקר כלים בין בעלי חיים באמצעות מעקר חרוזים מחומם (עד פי 3).
2. יש להרדים את העכברים בהתאם לפרוטוקול הטיפול בבעלי חיים של המשתמשים (למשל, איזופלורן (4% לזירוז, 1-2% תחזוקה) ולתת משככי כאבים (תת עורי, 0.1 מ"ל של 0.1 מ"ג/ק"ג בופרנורפין SR-LAB) לפני תחילת הניתוח. הקפידו על עומק הרדמה אופטימלי עם צביטה בבוהן.
3. הניחו את העכברים במסגרת סטריאוטקסית ושיתקו את הראש באמצעות מוטות אוזניים סטנדרטיים (איור 1A). לאחר מכן, מרחו משחה עיניים על העיניים.
4. עקר את פני הראש על ידי מריחה חוזרת לסירוגין (3x) של ספוגיות יוד ואתנול 70% לפני החתך.
5. השתמש באזמל כירורגי כדי לבצע חתך בקו האמצע של 1 ס"מ דרך העור בזווית מעט אלכסונית לקו הדמיוני המחלק את מוחו של העכבר לשני חצאים סימטריים כדי לחשוף את הגולגולת. נגב כל דם בעזרת צמר גפן.
6. הסיט את העור לרוחב כדי לחשוף את מקום ההזרקה: 2 מ"מ מימין, 1 מ"מ קדימה בהתייחס לברגמה +2 מדיולטרלי (+2 מ"ל), +1 רוסטרלי/זנב (+1RC).
7. השתמש בביט בור (0.73 מ"מ) כדי לחדור לגולגולת +2ML, +1RC לברגמה ולקדוח חור באמצעות לחץ קל ותנועת פיתול.
8. השתמש במזרק הזרקה למוח כדי להזריק 5 מיקרוליטר של 100,000 תאי MDA-MB-231BR (חלבון פלואורסצנטי ירוק או GFP-לוציפראז) / תמיסת מיקרוליטר בתמיסת מלח סטרילית 1x פוספט (PBS) על ידי החדרת המזרק בעומק 3.5 מ"מ למוח.
9. הניחו למזרק להתייצב למשך 2 דקות. משכו אותו כלפי מעלה כ-1 מ"מ, ולאחר 2 דקות, הזריקו לאט את המחצית הראשונה של הנפח.
10. המתן עוד 2 דקות לפני הזרקת השאר, ולאחר מכן משוך לאט את המזרק 3 דקות לאחר ההזרקה האחרונה. הערה: הזרקה איטית היא אמפירית בכך שהיא מאפשרת לנפח להיספג היטב ברקמת המוח ולא ליצור דליפה לאחר משיכת המזרק, מה שעלול להוביל לצמיחת תאים סרטניים מחוץ לאתר המיועד.
11. מרחו שעוות עצם על מקום ההזרקה בגולגולת ולאחר מכן השתמשו בתפרי פוליפרופילן כדי לתפור את הרקמה. עכברים יתאוששו תוך 5 דקות לאחר הסרת ההרדמה.
12. עקוב אחר התנהגותם מיד לאחר הניתוח במשך כ-10 דקות, 3 שעות לאחר מכן ולמחרת כדי לקבוע אם יש צורך בטיפול מיוחד, כולל הזרקת מי מלח, מזון רך וכו', כדי לסייע בהחלמה מהירה.
13. עקוב אחר צמיחת הגידול באמצעות הדמיה ביולומינסנציה על מערכת ההדמיה.
    1. לשם כך, ראשית, הפעל את החמצן והאיזופלורן במערכת ההדמיה. אפשר לחלק את שניהם לתא נפרד מחוץ לקופסת ההדמיה.
    2. לאחר מכן, הפעל את התוכנה, אתחל את המכשיר ובחר באפשרות המתאימה להדמיה ולכידת כל גוף העכבר.
14. הניחו את העכברים בתא נפרד עם איזופלורן והבטיחו עומק הרדמה אופטימלי עם צביטה בבוהן. להזריק לעכברים תוך צפקית 200 מיקרוליטר של 30 מ"ג/מ"ל לוציפרין.
15. העבירו את קיבת העכברים למטה אל האף של תא ההדמיה המסופק עם חמצן ואיזופלורן. נעל את החדר ובחר חשיפה של 2 דקות כדי להתחיל בהדמיה.
16. השתמש בכלי ה-ROI (אזור עניין) של התוכנה כדי לכמת את האות הביולוגי של הגידול.
17. כדי לנתח את גודל הגידול, בחר בכלי צורת העיגול כדי להתאים אותו סביב צורת הגידול וגודלו. מדוד את ההחזר על ההשקעה ודווח על סך הקריאות.
18. אפשרו גדילה של גידול מוצק במשך 12-14 ימים (או עד שלוציפראז מגיע לכ-7.0 x 10⁶ יחידות) (איור 1B) לפני יצירת פרוסות מוח. הערה: הגדלת מספר התאים להזרקה תוביל לצמיחה מהירה יותר של הגידול; לכן, יצירת פרוסות מוח יכולה להתרחש מוקדם יותר מ-12 יום. מצד שני, גידול גדול יותר יוביל ליותר פרוסות GFP+ אם יאפשרו לו לגדול במשך 14 יום. לאחר 14 יום, בריאותם של העכברים מתחילה להידרדר במהירות; לפיכך, יש להגביר את ניטור בריאות בעלי החיים לפעם ביום לאחר נקודת הזמן של 10 ימים, ויש להשתמש בכל עכברים המראים סימני כאב ו/או אי נוחות כדי ליצור את הפרוסות.

2. צור פרוסות מוח

הערה: בצע את השלבים לאחר בידוד המוח במכסה זרימה למינרי סטרילי. בדרך כלל ניתן לייצר 35-40 פרוסות בודדות המכילות תאי גידול (אות לוציפראז) מעכבר אחד שהוזרק עם תאי MDA-MB-231BR (איור 1C).

1. עקר את כל כלי הניתוח בחיטוי. הנח את פורס הרקמות במכסה המנוע הזרימה הלמינרית הסטרילית ונקה את כל הכלים והמכשירים עם 70% אתנול.
2. לאחר 12-14 ימים לאחר הזרקת תאי MDA-MB-231BR תוך גולגולתיים, יש להרדים את העכברים בהתאם לפרוטוקול הטיפול בבעלי חיים של המשתמש כמתואר בסעיף 1.2. הקפידו על עומק הרדמה אופטימלי עם צביטה בבוהן.
3. הסר והכניס את מוחם במהירות (תוך 45 שניות) לתוך נוזל מוחי שדרתי מלאכותי סוכרוז קר כקרח (4 מעלות צלזיוס) או סוכרוז-ACSF המורכב מהדברים הבאים: 280 מ"מ סוכרוז, 5 מ"מ אשלגן כלורי (KCl), 2 מ"מ מגנזיום כלוריד (MgCl₂), 1 מ"מ סידן כלורי (CaCl₂), 20 מ"מ גלוקוז, 10 מ"מ 4-(2-הידרוקסיאתיל)-1-פיפרזינאתיאנסולפונית חומצה או HEPES, 5 מ"מ נתרן (Na+)-אסקורבט, 3 מ"מ תיאוריאה, 2 מ"מ Na+, 29 מ"מ פירובאט; pH=7.3.
4. בעזרת אזמל חד וסטרילי או סכין גילוח, חתכו חלקים עודפים במוח שאינם מכילים גידול מכל הצדדים, כולל החלק התחתון של המוח.
5. הביאו את צורת המוח לקובייה לא מושלמת כדי לשבת שטוחה על נייר הסינון הרטוב ב-ACSF על מכסה צלחת 60 מ"מ כדי להקל על החיתוך. הערה: רקמה נוספת של המוח שבה לא סביר שהגידול גדל מוסרת לפני החיתוך כדי לאפשר יצירת פרוסות GFP+ בעיקר וליצור צורת מוח יציבה על פני המכשיר ולא תהיה מופרעת על ידי הרעידות הנגרמות על ידי החיתוך.
6. הניחו כמה גיליונות של עיגולי נייר סינון רטובים מראש (עם ACSF) על משטח החיתוך והניחו את הרקמה החסומה מעליה.
7. הגדר את גודל החיתוך במכשיר ל-2 או 2.5 יחידות על הסרגל המצורף כדי לפרוס את הרקמה למקטעים של 200-250 מיקרומטר. הערה: פרוסות עד 350 מיקרומטר או דקות עד 100 מיקרומטר הן ברות קיימא. לפרוסות <200 מיקרומטר, השתמש בוויברטום או קומפרסום.
8. השתמש במכחול (סייבל) כדי להעביר פרוסות מוח לכלי המכיל סוכרוז ACSF והפרד את הפרוסות תחת מיקרוסקופ אור באמצעות מחטים של 27 גרם.
9. זהה פרוסות חיוביות ל-GFP תחת המיקרוסקופ הפלואורסצנטי והעביר אותן לצלחת חדשה בגודל 60 מ"מ המכילה 2-3 מ"ל של חומר פרוסה בוגר (מדיום נוירו-בזאלי A, תוסף B12 2%, תוסף N2% 1%, 1% גלוטמין, 0.5% גלוקוז, 10 פניצילין U/mL וסטרפטומיצין 100 מיקרוגרם/מ"ל) באמצעות פיפטה סטרילית של 1 מ"ל שבורה (פתח רחב). הערה: פרוסות המוח המכילות תאי גידול הגדלים על פני המוח (אולי עקב דליפת תאי הזרקה וכו') אינן נכללות.
10. מעבירים 3-5 פרוסות על כל 30 מ"מ, תוספת תרבית נקבוביות בגודל 0.4 מיקרומטר בצלחות של 6 בארות במרחק שאינו מאפשר לצמוח זו לזו.
11. הסר את המדיום העודף מפני השטח של התוספת באמצעות פיפטה P1000, הוסף 1 מ"ל של מדיום פרוסת עכבר בוגר מתחת לכל תוספת ואזן את המדיה בחממה לפני החיתוך.
12. דגרו על הרקמות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, 5% CO₂ ו-95% לחות למשך 24 שעות לפני ההדמיה.

3. הדמיית מערכת הדמיה In Vivo (IVIS) של פרוסות

הערה: בצע שלבי הוספת לוציפראז ומעכב במכסה זרימה למינרי סטרילי.

1. פיפטה 5 מיקרוליטר של תמיסת לוציפרין של 30 מ"ג/מ"ל לתוך המדיום שמתחת לתוספות על ידי הרמת התוספת בעזרת מלקחיים והחזרתם לבאר לאחר הוספת לוציפרין למדיה בבאר.
2. הנח את צלחת 6 הבארות עם המכסה בתוך תא ההדמיה של המכשיר מתחת למצלמה הנייחת ונעל את דלת החדר.
3. פתח את התוכנה ואתחל את המכשיר.
4. בחר הגדרות מצלמה המאפשרות הדמיה ולכידה של באר אחת בלבד לכל תמונה. הזיזו את ה-stage למעלה (שדה ראייה או FOV של 5 ס"מ) והניחו את הבאר שיש לצלם ישירות מתחת למצלמה.
5. הגדירו את זמן ההדמיה למתאים ביותר בהתאם לעוצמת הלוציפראז שהגידול יפלוט, שיכול לנוע בין 10 שניות ל-5 דקות. התחילו בהגדרתו ל-10 שניות ואז הגדילו אם האות נמוך, אך שמרו אותו עקבי לכל נקודות הזמן והתנאים עד לסוף הניסוי (איור 1D).
6. השתמש בכלי ה-ROI (כלי צורת עיגול), התאם אותו סביב צורת הגידול וגודלו, מדוד את ההחזר על ההשקעה ודווח על סך הקריאות כדי לכמת את האות הביולוגי של כל גידול על הפרוסה.

תוצאות

איור 1. הזרקה תוך גולגולתית, יצירת פרוסות מוח וצמיחת BCBM ex vivo. (A) ייצוג סכמטי של עכבר במהלך הזרקה תוך גולגולתית תחת מכשיר סטריאוטקטי. (B) תמונות מייצגות של זיהוי ביולומינסנט של גידולים מעכברי Nu/Nu בני 4-6 שבועות שהוזרקו עם 5 x 10^...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
1 מ"ל מזרק, קצה החלקה	BD	309659
30 G1/2 מחטים	BD	305106
צלחות 6 בארות	Genessee	25-105
מיקרוסקופ אוטומטי ותוכנת LUMAVIEW	Etaluma	LS720
B27 (GEM21)	Gemini Bio-Products	400-160
כוס 50 מ"ל	פישר	10-210-685
מברשת סייבל קהה, גודל #5/0	מדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית	66100-50
שעוות עצם	ModoMed	DYNJBW25
מזרק	הזרקת מוחחברת המילטון	80430
CaCl₂	Fisher Scientific	BP510-250
D-Luciferin מלח אשלגן	פרקין אלמר	122799
סכין גילוח כפול	VWR	55411-060(95-0043)
נייר סינון (# 1), עיגולים כמותיים, 4.25 ס"מ	פישר	09-805a (1001-042)
מברשת סייבל עדינה #2/0	מדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית	66100-20
מלקחיים	כלים מדעיים עדינים	11251-20
גלוקוז	סיגמא אולדריץ'	G8270
גלוטמין (200 מ"מ)	קורנינג cellgrow	25-005-Cl
עם מקדחי מיקרו מיני טוויסט	אמזון	YCQ2851920086082DJ
HEPES, חומצה חופשית	Fisher Scientific	BP299-1
רק לעכברים Stereotaxic Frame	מכשיר הרווארד (הוליסטון, מסצ'וסטס, ארה"ב).	72-6049, 72-6044
KCl	Fisher Scientific	S271-10
מספריים כירורגיים גדולים	Fine Science Tools	14001-18
תאי MDA-MB-231BR	מסופק באדיבות על ידי ד"ר פטרישיה סטיג	Ref 14
MgCl₂·6H₂O	Fisher Scientific	M33-500
	Perkin Elmer	IVIS 200 System
Mice תוכנת הדמיית עכברים	Caliper Life Sciences (וולת'ם, מסצ'וסטס, ארה"ב).		תמונה חיה
קורא Microplate	Tecan Spark
פתרון הרכבה	Invitrogen	P36935
MTS מגיב	Promega CellTiter 96 פתרון אחד מימי	(Cat:G3582)
תוסף N2	Life Technologies	17502-048
חיים בינוניים נוירובזאליים	טכנולוגיות	21103049
עכברים אתימיים Nu/Nu	מעבדות צ'ארלס ריברס (ווילמינגטון, מסצ'וסטס, ארה"ב)
Paraformaldehyde	Affymetrix	19943
Pen/Strep	Life Technologies	145140-122
אספקת תפרים מפוליפרופילן	Medex	ETH-8556H
ספוגית יוד פובידון מקלות	DME אספקת ארה"ב	חתול: 689286X
להב אזמל #11 (pk של 100)	Fine Science Tools	10011-00
ידית אזמל #3	Fine Science Tools	10003-12
נתרן פירובט	סיגמא אולדריץ'	S8636
מרית/בדיקה	כלי מדע עדינים	10090-13
סכיני גילוח לא מצופים SS כפול קצה (סכין גילוח בטיחות אמריקאי (95-0043))VWR		55411-060
סוכרוז	אמרסקו	57-50-1
אזמל כירורגי	Exelint International	D29702
קוצץ רקמות	ברינקמן	(סוג McIlwain)
תרבית רקמות מוסיף	Millipore	PICMORG50 או PICM03050

סט מקדחות יד מכשיר הדמיית עכברים תוכנת