הדמיית דור הרמוני שני במודל חולדה לחקר פגמים בטובולין

תקציר

מקור: Piazza, V., et al., אופטיקה לא ליניארית ללא תוויות לחקר פגמים תלויי טובולין במיאלין המרכזי. J. Vis. Exp. (2023)

סרטון זה מדגים את ההליך להדמיית חריגות מיקרו-צינוריות בפרוסת רקמת מוח של חולדה באמצעות מיקרוסקופ עירור של שני פוטונים. הוא משתמש באותות דור הרמוני שני (SHG) כדי לזהות פגמים בטובולין וייצור מיאלין מופחת.

פרוטוקול

כל ההליכים הכוללים דגימות של בעלי חיים נבדקו ואושרו על ידי ועדת הביקורת האתית המתאימה לבעלי חיים.

1. העבירו למיקרוסקופ

1. אם המיקרוסקופ נמצא בחדר אחר, הכינו קופסה מבודדת עם חבילות ג'ל מחוממות כדי להעביר את חלקי הרקמה תוך שמירה על הטמפרטורה. הקופסה גם תשמור על חום החלקים עד שהם מצולמים.
2. שים את הדגימה מתחת למיקרוסקופ, וודא שהיא ממוקמת כראוי מתחת למטרה על ידי תצפית ישירה דרך העיניים עם האור המועבר.
   הערה: המטרה היא ליישר את המבנים הפולטים החזויים עם כיוון התנודה של הלייזר כדי למקסם את אות הדור ההרמוני השני (SHG) הנפלט (ולכן זוהה).
3. הסר את עודפי ה- HBSS כך שסרט נוזלי דק יכסה את כל הדגימה. בדוק ויזואלית את הסרט הנוזלי כל כמה דקות כדי למנוע אידוי וייבוש מוגזם של הדגימה.
   הערה: בתנאים המתוארים, נעשה שימוש במקטע למשך לא יותר מ-20 דקות. ייבוש הדגימה גורם להשפעות ארטיפקטיות דרסטיות (איור 1A). אם יש צורך בזמני הדמיה ארוכים יותר, מומלץ להשרות את הקטע במדיום חם ורענן במקום להוסיף עוד HBSS. מומלץ להשתמש בתאי זלוף ודבק או אגרוז נמס נמוך כדי לשתק את הרקמה גם כאשר יש לבצע ניסויים ארוכים יותר.
4. הכן את שלב המיקרוסקופ להדמיה שאינה סרוקה, שעשויה לכלול סגירת כל דלתות תא הדגירה הכהה או כיסוי תא הדגירה בבד מצופה פוליאוריטן ניילון שחור.

2. הדמיה

1. בחר את מצב ההדמיה "non-descanned" לאורך נתיב השידור. בדרך זו, לכידת אות ה-SH החלש של טובולין תהיה אופטימלית.
2. בחר את יעד LCI Plan-Neofluar 25x/0.8 NA.
3. הגדר הספק לייזר בין 13 mW ל -26 mW, עם זמן שהיית פיקסלים של 12.6 μs. צלם תמונות שאינן גדולות מ-512 פיקסלים על 512 פיקסלים, במהירות של 5 ובממוצע של 2, למשך זמן רכישה ממוצע של כ-15 שניות.
   הערה: שימוש בעוצמות לייזר גבוהות יותר ו/או זמני שהייה ארוכים יותר עלול לפגוע בדגימה (איור 1B).
4. צלם תחילה תמונות באמצעות מסנן מעבר קצר של 485 ננומטר (SP485), ובשלב שני, הוסף מסנן פס פס חד של 405 ננומטר (BP405; איור 2).
   הערה: ניתן לצלם תמונות פסאודו-שדה בהיר דרך אותו גלאי באמצעות אור הלייזר השיורי של קו גלוי (לייזרים של 405 ננומטר או 488 ננומטר עובדים בצורה הטובה ביותר).

תוצאות

איור 1: דוגמאות לחפצים. (A) חפץ עקב ייבוש הדגימה. (B) חפץ עקב חשיפה מוגזמת. פסי קנה מידה: 30 מיקרומטר.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
405/10 nm BrightLine(R) מסנן פס פס יחיד	Semrock	FF01-405/10-25	קוטר 32 מ"מ, עם טבעת דיור
ניילון שחור, בד מצופה פוליאוריטן	Thorlabs	BK5	5' x 9' (1.5 מ' x 2.7 מ') x 0.005 אינץ' (0.12 מ"מ) עובי
מיקרוסקופ קונפוקלי	Zeiss	LSM710NLO AxioObserver Z1	מיקרוסקופ הפוך, המטרה המשמשת היא LCI Plan-Neofluar 25x/0.8 NA
Hanks' תמיסת מלח מאוזנת (HBSS)	Gibco	14025-076	ניתן להכין מאבקות
מודול NDD, סוג C	Zeiss	000000-1410-101	כדי לזהות את האות, להפחית את אובדן האור. מכיל את סט המסננים 000000-1935-163 עם SP485
Phosphate buffered salt (PBS)	Gibco	10010-031	ניתן להכין מאבקות או לשוניות
לייזר פועם	קוהרנטי	זיקית Vision II	680–1080 ננומטר לייזר מתכוונן