הדמיה קונפוקלית של דינמיקה דנדריטית עצבית באקספלנטים של רשתית עכבר

תקציר

מקור: Ing-Esteves, S. & Lefebvre, J. L. הדמיית זמן-lapse של ארבוריזציה עצבית באמצעות תיוג דליל של וירוסים הקשורים לאדנו. J. Vis. Exp. (2021)

סרטון זה מדגים את השימוש במיקרוסקופיה קונפוקלית כדי להמחיש דינמיקה דנדריטית בצמחי רשתית של עכבר חי. הוא מתאר את השלבים לייצוב הרשתית תחת מיקרוסקופ קונפוקלי, ביצוע הדמיה אפיפלואורסצנטית כדי לדמיין אינטרנוירונים אמקריניים של התפרצות כוכבים, ולכידת תמונות תלת מימד בהילוך מהיר כדי לנטר שינויים במורפולוגיה דנדריטית אמקרינית.

פרוטוקול

כל ההליכים הכוללים דגימות של בעלי חיים נבדקו ואושרו על ידי הוועדה המתאימה לבחינת אתיקה של בעלי חיים.

1. הדמיה קונפוקלית בהילוך מהיר של תכשירים חיים ברשתית שלמה

1. הרכיבו את תא הדגירה של הדמיה חיה למיקרוסקופ קונפוקלי זקוף, כפי שניתן לראות באיור איור 1.
   הערה: עבור מערכות קונפוקליות הפוכות, תאי גנגליון רשתית (RGC) ממוקמים עם הצד כלפי מטה ישירות על כיסוי תחתון הזכוכית של תא הדגירה. ברגע שהרשתית יוצרת מגע עם הכיסוי, לא ניתן להזיז אותן.
2. מלאו את החדר בנוזל מוחי שדרה מלאכותי מחומצן (aCSF) והפעילו את המשאבה ואת בקר הטמפרטורה (טמפרטורה 32-34 מעלות צלזיוס, קצב זרימה 1 מ"ל/דקה). אל תאפשר לטמפרטורה לעלות מעל 34 מעלות צלזיוס.
3. כדי להעביר את התושבת השטוחה של הרשתית לתא הזלוף, עצור את המשאבה והסר את ה-aCSF שנמצא בתא. הנח את דיסק אסטר התאית המעורב (MCE) עם תושבת הרשתית השטוחה לתוך תא הדגירה (הריק).
4. הנח משקל דגימה על התושבת השטוחה; הרטיבו מראש את המשקל כדי לשבור את מתח הפנים. מלאו מחדש את החדר ב-aCSF המחומם, והפיצו את aCSF ב-~1 מ"ל/דקה.
5. מקם את האף עם מטרת טבילת המים פי 25 (צמצם מספרי 0.95) לתוך תא ההדמיה. מסך עבור התאים המסומנים המעניינים באמצעות אור אפיפלואורסצנטי (איור 1C).
6. כוונן את עוצמת הקול של ההדמיה כדי ללכוד תכונות דנדריטיות מעניינות.
   הערה: מחקר זה לכד את הסוכה הדנדריטית השלמה ב-1024 x 1024 פיקסלים למסגרת, צעד z-1 מיקרומטר וקצב פריימים של 2 דקות בין כל מחסנית z. גדלי התמונה הסופיים הם ~100 מיקרומטר x 100 מיקרומטר x 20 מיקרומטר.
7. כדי להתאים את עוצמת הלייזר להגדרה אופטימלית, השתמש בטבלת חיפוש המזהה פיקסלים רוויים מדי ותת-רוויים. בזמן הסריקה, כוונן את עוצמת הלייזר כך שאף פיקסל לא יהיה רווי יתר על המידה (כלומר, בעוצמה של 255 ומעלה). המשך בהדמיה כל עוד נדרש או עד שתהיה ירידה משמעותית וניתנת לזיהוי באות הפלואורסצנטי ועלייה ברעש (בדרך כלל 2-4 שעות).
   הערה: מומלץ להפחית את עוצמת הלייזר מכיוון שאלגוריתמים של דה-קונבולוציה פועלים בצורה אופטימלית כאשר פיקסלים מפוזרים על פני הטווח הדינמי המלא. עוצמת הפיקסלים לא תעלה על 254; ניתוחים אמפיריים של נויריטים גילו שערכי פיקסלים מתחת ל-170 הם אידיאליים לדה-קונבולוציה. מהירויות סריקה גבוהות (400-600 הרץ) עם ממוצע קווים (2-3) עדיפות על סריקות בודדות ואיטיות יותר של אותו זמן שהייה כולל של פיקסלים. אזור ההדמיה הממושכת לעתים קרובות עובר פוטו-מלבינה, אך קטעי אקספלנט אחרים נשארים ברי קיימא. ניתן לצלם מספר אזורים בהרכבה שטוחה, כל אחד למשך 2-4 שעות, עם זמן דגירה כולל של 6 שעות. מפגשי הדמיה מעבר ל-6 שעות לא נבדקו באופן שיטתי. פירוק נויריט ובליבינג הם סימנים לכך שהכדאיות של האקספלנט יורדת.

תוצאות

איור 1: מערך תא דגירה של הדמיה של תאים חיים. (A) מכשירי דגירה להדמיה חיה שמציגים רכיבי חימום, תמיסה והדמיה. תנור חימום כפול כולל פלטפורמת תא דגירה מחוממת (עיגול אחורי עם אלקטרודות מחבר כחולות) ומחמם תמיסה מקוון. (B) דיאגרמה ס...

חומרים