הדמיה וכימות של התחדשות אקסונלית בנוירונים של גנגליון רשתית של חולדה

תקציר

מקור: Portela-Lomba, M., et. al. קוקולטורה של נוירונים של גנגליון רשתית של חולדה עם גליה מעטפת ריח, כמודל במבחנה של התחדשות אקסונלית בוגרת. J. Vis. exp. (2020).

סרטון זה מדגים הדמיה וכימות של התחדשות אקסונלית בתאי עצב גנגליון רשתית של חולדות אקסוטומיות (RGNs) בתרבית משותפת עם תאי גליה עוטפים ריח אנושיים אימורטליים. RGNs הם בעלי תווית חיסונית, עם סומות אדומות ואקסונים ירוקים. התמונות צולמו באמצעות מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי, ואחוז הנוירונים עם אינדקס התחדשות אקסוני ואקסונלי כומת באמצעות תוכנת הדמיה.

פרוטוקול

כל ההליכים הכוללים דגימות של בעלי חיים נבדקו ואושרו על ידי ועדת הביקורת האתית המתאימה לבעלי חיים.

1. תרבית גליה לריח אנושי (ihOEG, Ts12 ו-Ts14) תרבית

} הערה: הליך זה נעשה בתנאים סטריליים בארון בטיחות ביולוגית של תרבית רקמות.

1. הכן מדיום תרבית OEG של 50 מ"ל ME10.
2. הכן 5 מ"ל של Dulbecco's Modified Eagle Medium או DMEM/F12-Fetal Bovine Serum (FBS), בצינור חרוטי של 15 מ"ל.
3. יש לחמם את שני המצעים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באמבט מים נקיים למשך 15 דקות.
4. יש להפשיר בקבוקוני תאים Ts12 ו-Ts14 בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באמבט מים נקיים.
5. השעו מחדש והוסיפו תאים למדיום התרבית DMEM/F12-FBS שהוכן בשלב 2.
6. צנטריפוגה למשך 5 דקות ב-200 x גרם.
7. שאפו את הסופרנטנט.
8. הוסף 500 מיקרוליטר של מדיום ME10 והשהה מחדש את הגלולה.
9. הכינו צלחת תרבית תאים p60 עם 3 מ"ל של ME10 והוסיפו את המתלה הסלולרי בצורת טיפה.
10. העבר כדי להפיץ את התאים באופן אחיד על פני הצלחת.
11. תאי תרבית ב-37 מעלות צלזיוס ב-5% CO₂.
    הערה: לאחר ההגעה למפגש, יש לבצע לפחות מעבר נוסף כדי לייעל את התאים לתרבית משותפת. יש צורך במפגש של 90% לפני שזורעים אותם על הכיסויים לקוקולטורה. ל-p-60 יש מספר תא ממוצע של 7 x 10⁵ עבור Ts14 ו-2.5 x 10⁶ עבור שורות תאים של Ts12. יש להעביר קווי תאים Ts12 ו-Ts14 כל 2-3 ימים.

2. הכנת ihOEG (Ts12 ו-Ts14) לבדיקה

הערה: שלב זה חייב להיעשות 24 שעות לפני דיסקציה וקוקולטורציה של נוירוני גנגליון רשתית (RGNs).

1. טפל בכיסויים של 12 מ"מ Ø עם 10 מיקרוגרם/מ"ל פולי-L-ליזין (PLL) למשך שעה אחת.
   הערה: ניתן להשאיר את הכיסויים למשך הלילה בתמיסת PLL.
2. שטפו את הכיסויים עם 1x מי מלח פוספט (PBS) שלוש פעמים.
3. נתק תאי Ts12 ו-Ts14 ihOEG מצלחת תרבית התאים p60.
   1. הוסף 4 מ"ל של מדיום תרבית DMEM/F12-FBS לצינור חרוטי של 15 מ"ל. יש לחמם בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באמבט מים נקיים.
   2. מוציאים את המדיום מהצלחות ושוטפים את התאים פעם אחת עם 1 מ"ל של 1x PBS-ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA).
   3. הוסף 1 מ"ל של טריפסין-EDTA לתאי ה-OEG ודגר במשך 3-5 דקות ב-37 מעלות צלזיוס, 5% CO₂.
   4. אוספים תאים עם פיפטה p1000 ומעבירים אותם למדיום שהוכן בשלב 3.1.
   5. צנטריפוגה למשך 5 דקות ב-200 x גרם.
   6. שאפו את הסופרנטנט.
   7. הוסף 1 מ"ל של מדיום ME10 והשהה מחדש את הגלולה.
   8. ספרו את מספר התא בהמוציטומטר.
4. זרע 80,000 תאי Ts14 או 100,000 תאי Ts12 / באר על הכיסויים בצלחות של 24 בארות ב -500 מיקרוליטר של מדיום ME10.
5. תאי תרבית ב-37 מעלות צלזיוס ב-5% CO₂ למשך 24 שעות.

3. דיסקציה של רקמת הרשתית

} הערה: חולדות וויסטאר זכרות בנות חודשיים משמשות כמקור RGN. שתי רשתית (חולדה אחת) ל-20 בארות של צלחת תאים של 24 בארות. חומר כירורגי חיטוי לפני השימוש. ערכת דיסוציאציה של פפאין נרכשת באופן מסחרי ( טבלת חומרים). עקוב אחר הוראות הספק להרכבה מחדש. הרכיבו מחדש חומצה D, L-2-אמינו-5-פוספונובלרית (APV) במלאי של 5 מ"מ והכינו את האליקוטים.

1. ביום הבדיקה, הכינו את המדיה הבאה.
   1. הכינו צלחת תרבית תאים p60 עם 5 מ"ל תמיסת מלח מאוזנת של ארל קר או EBSS (בקבוקון 1 של ערכת דיסוציאציה פפאין).
   2. הכינו צלחת תרבית תאים p60 עם בקבוקון 2 משוחזר (פפאין) של ערכת הדיסוציאציה של הפפאין בתוספת 50 מיקרוליטר של APV. לאחר מכן, הוסף 250 מיקרוליטר של בקבוקון 3 משוחזר (DNase בתוספת 5 מיקרוליטר של APV).
   3. בשפופרת סטרילית, מערבבים 2.7 מ"ל של בקבוקון 1 עם 300 מיקרוליטר של בקבוקון 4 (מעכב פרוטאז אלבומין-אובומוקואיד). הוסף 150 מיקרוליטר של בקבוקון 3 (DNase) בתוספת 30 מיקרוליטר של APV.
   4. הכן 20 מ"ל של מדיום Neurobasal-B27 (NB-B27).
2. להקריב חולדה על ידי חנק עם CO₂.
3. הסר את הראש על ידי עריפת ראש עם גיליוטינה; מניחים אותו בצלחת פטרי 100 מ"מ ומרססים את הראש ב-70% אתנול לפני שמניחים אותו במכסה זרימה למינרית.
4. חותכים את שפם החולדה במספריים כדי שלא יפריעו למניפולציה של העיניים.
5. אחזו בעצב הראייה בעזרת מלקחיים כדי לשלוף את גלגל העין מספיק כדי שתוכלו לבצע חתך לרוחב העין בעזרת אזמל.
6. הסירו את העדשה ואת הזגוגית ומשכו החוצה את הרשתית (רקמה דמוית כתום), בעוד שאר שכבות העין נשארות בפנים (כולל שכבת האפיתל של הפיגמנט).
7. מניחים את הרשתית בתבנית תרבית התאים p60 שהוכנה בשלב 3.1.1.
8. מעבירים את הרשתית לתבנית תרבית התאים p60 שהוכנה בשלב 3.1.2 וחותכים אותה עם האזמל לחתיכות קטנות בגודל משוער < 1 מ"מ.
9. מעבירים לצינור פלסטיק של 15 מ"ל.
10. דגרו את הרקמה למשך 30 דקות באינקובטור לח בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס מתחת ל-5% CO₂, עם תסיסה כל 10 דקות.
11. נתקו גושי תאים על ידי פיפטה למעלה ולמטה עם פיפטה פסטר מזכוכית.
12. צנטריפוגה של תרחיף התא ב-200 x g למשך 5 דקות.
13. השליכו את הסופרנטנט, וכדי לנטרל את הפפאין, השעו מחדש את כדורית התא בתמיסה שהוכנה בשלב 3.1.3. (1.5 מ"ל לשתי עיניים).
14. פיפטה בזהירות את תרחיף התא הזה לתוך 5 מ"ל של בקבוקון 4 משוחזר.
15. צנטריפוגה ב-200 x גרם למשך 5 דקות.
16. בזמן הצנטריפוגה, הסר לחלוטין את מדיום ME-10 מלוח התא OEG 24 בארות (שהוכן בעבר בשלב 2) והחלף אותו ב-500 מיקרוליטר של מדיום NB-B27 לבאר.
17. השליכו את הסופרנטנט והשעו מחדש את התאים ב-2 מ"ל של מדיום NB-B27.
18. צלחת 100 מיקרוליטר של תרחיף תאי רשתית, לכל באר של צלחת m24, על גבי כיסויים חד-שכבתיים שטופלו ב-PLL או OEG.
19. שמור על תרביות ב-37 מעלות צלזיוס עם 5% CO₂ למשך 96 שעות במדיום NB-B27.

4. צביעה חיסונית

1. לאחר 96 שעות, תקן את התאים למשך 10 דקות על ידי הוספת אותו נפח של 4% פרפורמלדהיד (PFA) ב-1x PBS למדיום התרבית (600 מיקרוליטר) (ריכוז סופי של PFA 2%).
2. הסר את המדיה וה-PFA מהצלחת של 24 בארות והוסף שוב 500 מיקרוליטר של 4% פרפורמלדהיד (PFA) ב-1x PBS. דגירה למשך 10 דקות.
3. השליכו את המתקן ושטפו 3 פעמים עם 1x PBS למשך 5 דקות.
4. חסום עם 0.1% טריטון X-100/1% FBS ב-PBS (PBS-TS) למשך 30-40 דקות.
5. הכן את הנוגדנים העיקריים במאגר PBS-TS באופן הבא: SMI31 (נגד חלבוני MAP1B ו-NF-H) נוגדן חד שבטי (1:500). 514 (מזהה חלבוני MAP2A ו-B) אנטי-סרום רב-שבטי של ארנב (1:400).
6. הוסף נוגדנים ראשוניים לקו-תרביות ודגר למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס.
7. למחרת, השליכו את הנוגדנים ושטפו את הכיסויים עם 1x PBS, 3 פעמים, למשך 5 דקות.
8. הכן את הנוגדנים המשניים במאגר PBS-TS באופן הבא: עבור SMI-31, אנטי-עכבר Alexa Fluor 488 (1:500). עבור 514, אנטי-ארנב Alexa-594 (1:500).
9. דגירה של תאים עם הנוגדנים המשניים הפלואורסצנטיים המתאימים למשך שעה, בטמפרטורת החדר או RT בחושך.
10. שטפו את הכיסויים עם 1x PBS, 3 פעמים, למשך 5 דקות, בחושך.
11. לבסוף, הרכיבו כיסויים עם אמצעי הרכבה ( טבלת חומרים) ושמרו אותם בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
    הערה: במידת הצורך, ניתן לבצע צביעת גרעינים פלואורסצנטיים עם DAPI (4,6-diamidino-2-phenylindole). לפני ההרכבה, דגרו על התאים למשך 10 דקות בחושך עם DAPI (10 מיקרוגרם/מ"ל ב-1x PBS). שטפו את הכיסויים 3 פעמים עם 1x PBS, ולבסוף, הרכיבו את הכיסויים עם אמצעי ההרכבה.

5. כימות התחדשות אקסונלית

הערה: הדגימות מכומתות תחת המטרה של פי 40 של מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי. יש לצלם לפחות 30 תמונות בשדות אקראיים, עם לפחות 200 נוירונים, כדי לכמת עבור כל טיפול. יש לחזור על כל ניסוי לפחות שלוש פעמים.

1. לכמת את אחוז הנוירונים עם אקסון (נויריט חיובי SMI31) ביחס לכלל אוכלוסיית ה-RGNs (מזוהה עם צביעה חיסונית חיובית של MAP2A/B 514 של גוף עצבי ודנדריטים).
2. כמת את מדד ההתחדשות האקסונלית או את האורך האקסונלי הממוצע (מיקרומטר/נוירון). פרמטר זה מוגדר כסכום האורכים (במיקרומטר) של כל האקסונים שזוהו, חלקי המספר הכולל של הנוירונים שנספרו, בין אם הם הציגו אקסון ובין אם לאו. אורך אקסונלי נקבע באמצעות התוסף NeuronJ של תוכנת התמונה ImageJ (NIH-USA).
3. חשב את הממוצע, סטיית התקן והמובהקות הסטטיסטית באמצעות התוכנה המתאימה.

חומרים