הדמיית תאים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי של השתקפות פנימית כוללת

Abstract

מקור: Daniele, F., et. al בדיקות GFP רגישות ל-TIRFM ו-pH להערכת דינמיקת שלפוחית נוירוטרנסמיטר בתאי נוירובלסטומה SH-SY5Y: הדמיית תאים וניתוח נתונים. J. Vis. exp. (2015).

סרטון זה מדגים את ההדמיה של תאי נוירובלסטומה אנושיים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי השתקפות פנימית כוללת (TIRF) כדי להמחיש שלפוחיות סינפטיות מתויגות פלואורופור. התאים מתמקדים תחילה במצב אפיפלואורסצנטי. לאחר מכן נעשות התאמות כדי להשיג השתקפות פנימית מוחלטת, וליצור גלים חולפים המעוררים באופן סלקטיבי פלואורופורים ליד הממברנה. לפני הדמיית TIRF, מוגדרים פרמטרי רכישה, ותדירות הדגימה מוגדרת.

Protocol

1. תרבית תאים וטרנספקציה

1. תרבית תאים SH-SY5Y
   הערה: הניסויים בוצעו באמצעות נוירובלסטומה אנושית SH-SY5Y (ATCC# CRL-2266). תאי SH-SY5Y גדלים כתערובת של אשכולות צפים ותאים דבקים. עקוב אחר ההוראות המדווחות בפרוטוקול (צפיפות תאים, יחס פיצול וכו') כדי שתאים שגדלים מחוברים היטב לכיסוי הזכוכית, וזה חיוני למיקרוסקופיה פלואורסצנטית של השתקפות פנימית כוללת (TIRFM).
   1. לפני שמתחילים, מתחת לארון הבטיחות הביולוגית של הזרימה הלמינרית, הכינו את הנפח המתאים של תמיסת מלח מאגר פוספט סטרילי (PBS) ומדיום תרבית.
      1. הכינו 50 מ"ל PBS בריכוזים של 150 מ"מ נתרן כלורי (NaCl), מאגר פוספט 24 מ"מ, pH 7.4. סנן את הפתרון.
      2. הכינו 50 מ"ל של מדיום תאים ממדיום הנשר המותאם (DMEM) של Dulbecco עם גלוקוז גבוה, 10% סרום בקר עוברי מומת בחום (FBS), פניצילין (100 U/ml), סטרפטומיצין (100 מיקרוגרם/מ"ל), L-גלוטמין (2 מ"מ) ונתרן פירובט (1 מ"מ). סנן את הפתרון.
   2. הסר את מצע הגידול המלא ושטוף את התאים עם 3 מ"ל PBS.
   3. דגרו על תאים עם 2 מ"ל של 0.05% חומצה טריפסין-אתילנדיאמינטטראצטית (EDTA) (לצלחת פטרי בגודל 6 ס"מ) למשך 5 דקות ב-37 מעלות צלזיוס, 5% CO_2, ונתקו תאים באמצעות פיפטה.
   4. השבת טריפסין על ידי הוספת 2 מ"ל של DMEM ואיסוף תאים על ידי צנטריפוגה ב-300 x g למשך 5 דקות.
   5. הסר את הסופרנטנט, הוסף 1 מ"ל של DMEM לגלולה, ופיפט את התמיסה למעלה ולמטה מספיק כדי לפזר תאים לתרחיף של תא בודד.
   6. מחלקים אותם 1:4 בצלחת פטרי חדשה בקוטר 6 ס"מ המכילה 3 מ"ל של מדיום שלם. שמור על תאים בתרבית בצלחות פטרי בקוטר 6 ס"מ ב-37 מעלות צלזיוס בחממה של 5% CO₂. תת-תרבות פעם בשבוע, או כאשר הם כיסו 80 - 90% משטח הפנים.
2. ציפוי תאים SH-SY5Y להדמיה
   1. עבור ניסויי TIRFM, תאי צלחת מונחים על כיסויי זכוכית. השתמש בכיסויי זכוכית בעובי של 0.17 ± 0.005 מ"מ ומקדם שבירה של 1.5255 ± 0.00015. לפני שמתחילים, הכינו את כיסויי הזכוכית באופן הבא:
      1. נקה מכסי זכוכית עם 90% אתנול למשך הלילה (O/N).
      2. שוטפים אותם היטב במים מזוקקים (שלושה החלפות של מים מזוקקים). כיסויי זכוכית יבשים בתנור ייבוש.
      3. מניחים את הכיסויים בכלי פטרי מזכוכית ומעקרים בתנור שחומם מראש ל-200 מעלות צלזיוס למשך 3 שעות.
   2. יום לפני הטרנספקציה, מניחים כל כיסוי בצלחת פטרי בגודל 3.5 ס"מ, מוסיפים 1 מ"ל של מדיום תרבית, ודוגרים בחום של 37 מעלות צלזיוס בחממה של 5% CO₂.
   3. טריפסין תאים כמתואר בשלבים 1.1.3 - 1.1.5, השהה את כדור התא ב -1 מ"ל של מדיום שלם וספירה. חשב את הנפח הנכון של תרחיף התאים להוספה לכל צלחת פטרי כדי להניב 3 x 10⁵ תאים/באר. צפיפות זו נדרשת לצמיחת תאים אופטימלית וטרנספקציה יעילה. דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בחממה של 5% CO₂ O/N.
3. SH-SY5Ytransfection על ידי פוליאתילנימין (PEI)
   } הערה: כדי להמחיש דינמיקה של שלפוחיות סינפטיות, נעשה שימוש בווקטור pCB6 המכיל סינפטו-pHluorin. הסינפטו-pHluorin נוצר על ידי היתוך בתוך המסגרת של גרסה רגישה ל-pH של החלבון הפלואורסצנטי הירוק (GFP) וחלבון הממברנה השלפוחית סינפטוברוין 2. המבנה שימש באופן נרחב כדי לחקור את תכונות השלפוחית הסינפטית בתוך נוירונים.
   1. לפני שתתחיל בטרנספקציה, הכינו 10 מ"ל מהפתרונות הבאים. שמור את הפתרונות למשך חודש אחד לכל היותר.
      1. הכינו תמיסת NaCl של 150 מ"מ. התאם ל-pH 5.5 עם 0.01 N חומצה הידרוכלורית (HCl).
      2. הכינו תמיסת PEI ב-10% פוליאתילנימין (PEI; 25 kDa ליניארי) בתמיסת NaCl של 150 מ"מ. ה- pH של התמיסה עולה ל 8.8. התאם את ה-pH ל-7.8 עם 0.01 N HCl.
   2. 24 שעות לאחר הציפוי, הסר את המדיום ורענן עם 1.5 מ"ל של מדיום שלם. שמור את התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בחממה של 5% CO₂.
   3. מתחת לארון הבטיחות הביולוגית של הזרימה הלמינרית, בצינור מיקרופוגה של 1.5 מ"ל, הוסף 3 מיקרוגרם של DNA פלסמיד ל-25 מיקרוליטר של תמיסת NaCl של 150 מ"מ ו-100 מיקרוליטר של תמיסת PEI לכל צלחת פטרי של 3.5 ס"מ.
   4. מערבולת למשך 10 שניות, ולאחר מכן דגירה על תערובת ה-DNA/PEI למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
   5. מוסיפים בזהירות את תערובת ה-DNA/PEI לצלחת הפטרי המכילה כיסויים עם תאים ומנערים בעדינות כדי לפזר באופן שווה את המגיב בצלחת הפטרי.
   6. לאחר 4 שעות, שנה את המדיום ודגר את התאים O/N ב-37 מעלות צלזיוס בחממה של 5% CO₂. בצע ניסויי הדמיה 24 - 48 שעות לאחר הטרנספקציה.

2. הדמיית תאים על ידי TIRFM

1. הגדרת הדמיה
   1. בצע הדמיית TIRF עם ההגדרה המתוארת ב-איור 1. הוא מורכב ממיקרוסקופ הפוך ממונע (איור 1, משובץ A), מקור הלייזר (איור 1, משובץ B), ומחוון TIRF (איור 1, משובץ C). הגע לתאורת TIRFM דרך צמצם מספרי גבוה (NA 1.45 Alpha Plan-Fluar) שמן 100X, מטרת טבילה.
   2. עבור תאורת TIRFM, השתמש בלייזר ארגון-יון רב-קווי (458/488/514 ננומטר) של 100 mW. באמצעות סיב מונו-אופן, הכנס את אור הלייזר המקוטב ליניארי לנתיב האלומה באמצעות מחוון TIRF. הכנס את מחוון ה-TIRF למישור הסרעפת של שדה האור הזוהר של נתיב אלומת האור המוחזר.
      1. לתאורת שדה רחב, חבר את המיקרוסקופ למנורת כספית קצרת קשת קונבנציונלית HBO אור לבן. פריזמה כפולה השומרת על קיטוב במחוון מבטיחה שילוב בו-זמני של תאורת TIRF ואור לבן.
   3. סנן את אור הלייזר עם מסנן עירור (רוחב פס 488/10 ננומטר) המותקן על גלגל פילטר והוכנס לנתיב הלייזר. השתמש בתריס מהיר הנשלט על-ידי תוכנה כדי לאפשר שליטה מהירה בתאורת הלייזר. לניתוח pHluorin, התקן מסנן פליטה של 525/50 ננומטר. צלם תמונות דיגיטליות (512 x 512 פיקסלים) במצלמת Fast CCD מקוררת עם תוכנת Image ProPlus.
2. השגת תאורת TIRF (איור 2)
   1. הפעל את הלייזרים, המחשב, המצלמה, גלגל המסנן ובקרי התריס; לאחר מכן, המתן 20 דקות לפני תחילת הניסוי מכיוון שהלייזרים צריכים להתחמם ולהתייצב.
   2. לפני ההדמיה, בצע את הנפח המתאים של הפתרונות הבאים.
      1. הכינו 50 מ"ל תמיסת קרבס (KRH) ב-125 מ"מ NaCl, 5 מ"מ אשלגן כלורי (KCl), 1.2 מ"מ מגנזיום גופרתי (MgSO₄), 1.2 מ"מ אשלגן דימימן פוספט (KH₂PO₄), 25 מ"מ 4-(2-הידרוקסיאתיל) חומצה פיפרזין-1-אתנסולפונית (HEPES) (חוצץ ל-pH 7.4), 2 מ"מ סידן כלורי (CaCl₂), ו-6 מ"מ גלוקוז.
      2. הכינו 10 מ"ל של תמיסת KCl-KRH (pH 7.4) ב-80 מ"מ NaCl, 50 מ"מ KCl, 1.2 מ"מ MgSO₄, 1.2 מ"מ KH₂PO₄, 25 מ"מ HEPES (חוצץ ל-pH 7.4), 2 מ"מ CaCl₂ ו-6 מ"מ גלוקוז.
   3. הסר את מכסה הזכוכית עם תאים שעברו טרנספטציה והכנס אותו לתא ההדמיה המתאים. הרכיבו את החדר והוסיפו 500 מיקרוליטר של תמיסת KRH במרכז הזכוכית.
   4. הוסף שמן מעל המטרה. הנח את תא ההדמיה על הבמה של המיקרוסקופ ומקם את האובייקט מתחת לכיסוי הזכוכית. מקם את המכסה הבטוח מעל הדגימה.
   5. במצב אפיפלואורסצנטי, התמקדו בכיסוי (המשטח העליון) ובחרו את התאים המועברים הממוקמים במרכז החדר. בחר תאים שניתן להקליט בבירור את האות הפלואורסצנטי שלהם באמצעות זמן חשיפה מתחת ל-80 אלפיות השנייה.
   6. תחת בקרת תוכנה, עבור לתאורת TIRF במצב חי.
   7. כדי להגדיר את תצורת ה-TIRF, בדוק את מיקום הקרן שיוצאת מהמטרה על מכסה המדגם (איור 2B). כאשר האלומה ממוקמת במרכז עדשת האובייקט (איור 2A, משמאל), ניתן לראות נקודה במרכז מכסה הדגימה של TIRF (איור 2B, משמאל), והתא מצולם במצב אפיפלואורסצנטי (כמה מישורי מיקוד, פלואורסצנטיות רקע גבוהה; איור 2C, משמאל).
   8. כדי להגיע לזווית הקריטית, הזז את הנקודה הממוקדת בכיוון Y (קדימה או אחורה; איור 2B, מרכז) באמצעות בורג כוונון הזווית במחוון TIRF ( איור 1C). כאשר האלומה מתכנסת על מישור הדגימה בזווית גדולה יותר מהזווית הקריטית (איור 2A, מימין), הנקודה נעלמת, וקו ישר, דק וממוקד נראה באמצע מכסה הדגימה (איור 2B, מימין).
   9. כדי לכוונן את זווית ה-TIRF, השתמשו בדגימת התא (איור 2C). צפו בתמונת הקרינה בסרטון. בשלב זה, תמונה דמוית אפיפלואורסצנציה עדיין נראית לעין. הזז בעדינות את הבורג עד להשגת מצב TIRF: רק מישור אופטי אחד של התא נמצא בפוקוס (כלומר, קרום הפלזמה במגע עם הכיסוי). התוצאה היא תמונה שטוחה עם ניגודיות גבוהה (איור 2C, מימין).
3. הדמיה לדוגמה
   1. הגדר את ניסוי קיטועי הזמן של ערוץ יחיד. כדי למזער את ההלבנה, צלם את התמונה באמצעות זמן חשיפה נמוך ורווח גבוה. זמני החשיפה המתאימים הם בין 40 - 80 מילי-שניות. רכוש תמונות בתדר דגימה של 1 - 2 הרץ. ניתן להעריך טוב יותר את קינטיקה של השלפוחית דגימה בתדר גבוה יותר (10 הרץ). זמן התצפית הרגיל הוא בדרך כלל 2 דקות.

Results

איור 1. הגדרת מיקרוסקופ TIRF. תצוגה סכמטית ותמונה (שיבוץ) של מערכת המיקרוסקופ TIRF. המערך כולל את המיקרוסקופ ההפוך הממונע Axio Observer Z1 (A), לייזר ארגון-יון רב-קווי 100 mW (B) ומחוון TIRF (C). אור הלייזר (קו ירוק) והאור הלבן (קו צהוב) מו...

Materials