מיקרוסקופיה פלואורסצנטית של השתקפות פנימית כוללת להדמיה של אירועים אקזוציטיים

In This Article

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מקור: Winkle, C. C., et al. שימוש במתודולוגיות משולבות להגדרת תפקיד אספקת קרום הפלזמה במהלך הסתעפות אקסון ומורפוגנזה עצבית. J. Vis. Exp. (2016)

סרטון זה מדגים מיקרוסקופיה פלואורסצנטית של השתקפות פנימית כוללת (TIRF) להמחשת אירועים אקסוציטיים בנוירונים בקליפת המוח. סמן חלבון פלואורסצנטי ירוק רגיש ל-pH (GFP) זוהר עם איחוי שלפוחית, עם עירור TIRF סלקטיבי הלוכד אקסוציטוזיס קרום-פרוקסימלי בהדמיית זמן-lapse.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. הדמיית אירועים אקזוציטיים באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית של השתקפות פנימית כוללת (TIRF)

הערה: פרוטוקול זה דורש ציוד מיקרוסקופיה מיוחד, כולל תא סביבתי לשמירה על טמפרטורה, לחות ופחמן דו חמצני (CO₂), מיקרוסקופ פלואורסצנטי של השתקפות פנימית הפוכה (TIRF) המצויד בתאורה אפיפלואורסצנטית, מטרת TIRF בהגדלה גבוהה/צמצם מספרי גבוה (NA), XYZ אוטומטי stage, וגלאי התקן מצמד מטען רגיש (CCD). פרוטוקול זה משתמש במיקרוסקופ הפוך אוטומטי לחלוטין המצויד באובייקט 100x 1.49 NA TIRF, לייזר מצב מוצק 491 ננומטר ו-CCD מכפיל אלקטרונים (EM-CCD). כל הציוד נשלט על ידי תוכנת הדמיה ובקרת לייזר. לפני תחילת פרוטוקול ההדמיה, הפעל את תא הסביבה, הבמה, המנורה, המחשב והמצלמה....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
Name	Company	Catalog Number	Comments
35mm זכוכית תחתית תאי הדמיה של תאים חיים	תאגיד Matek	p356-1.5-14-C	חייב להיות מצופה ב-1 מ"ג/מ"ל פולי-D-ליזין ולשטוף לפני ציפוי התאים
אולימפוס IX81-ZDC2 מיקרוסקופ הפוך	אולימפוס
למבדה LS קסנון מנורת	סאטר מכשירים החברה
סביבתית שלב עליון חממה	Tokai להיט
100x 1.49 NA TIRF מטרה	אולימפוס
אנדור iXon EM-CCD	Andor
תא TIRF תוכנת בקרה	אולימפוס		תוכנה המשמשת לשליטה לייזרים להדמיית TIRF
פיג'י (תמונה J)	NIH	ImageJ גרסה 1.49t
ארנב פוליקלונלי אנטי-אנושי VAMP2	איתות תאים	11829
פולי-D-ליזין	סיגמא	p-7886	מומס במים סטריליים ב-1 מ"ג/מ"ל

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission