$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. הדמיית אירועים אקזוציטיים באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית של השתקפות פנימית כוללת (TIRF)
הערה: פרוטוקול זה דורש ציוד מיקרוסקופיה מיוחד, כולל תא סביבתי לשמירה על טמפרטורה, לחות ופחמן דו חמצני (CO2), מיקרוסקופ פלואורסצנטי של השתקפות פנימית הפוכה (TIRF) המצויד בתאורה אפיפלואורסצנטית, מטרת TIRF בהגדלה גבוהה/צמצם מספרי גבוה (NA), XYZ אוטומטי stage, וגלאי התקן מצמד מטען רגיש (CCD). פרוטוקול זה משתמש במיקרוסקופ הפוך אוטומטי לחלוטין המצויד באובייקט 100x 1.49 NA TIRF, לייזר מצב מוצק 491 ננומטר ו-CCD מכפיל אלקטרונים (EM-CCD). כל הציוד נשלט על ידי תוכנת הדמיה ובקרת לייזר. לפני תחילת פרוטוקול ההדמיה, הפעל את תא הסביבה, הבמה, המנורה, המחשב והמצלמה.
- בחר את המטרה בתוך תוכנת הדמיה. לאחר שהמטרה נמצאת במקומה, הדק את מחמם המטרה סביב הצווארון.
- ודא שהמטרה מונמכת לחלוטין לפני אבטחת חממת הבמה במשבצת השלב. יוצקים מים מזוקקים באופן שווה לתוך כניסות החממה כדי למנוע שפיכה.
- הפעל את מערכת הדגירה. פתח את השסתום למיכל CO2 ואשר שהלחץ מתאים למערכת בהתאם להוראות היצרן. אפשר לתא זמן מה להגיע ל-5% CO2 ו-37 מעלות צלזיוס. לפני הוספת צלחת ההדמיה, הנח צלחת ריקה בחממה כדי למנוע עיבוי מים על המטרה.
- הפעל את מקור הלייזר.
- פתח את חממת הבמה והוסף שמן טבילה לעדשה. מניחים את הדגימה בחממה וייצבים אותה בעזרת זרועות יציבות או משקולת צלחת. הרם את המטרה עד שהשמן יוצר מגע עם תחתית הדגימה. עבור לתאורת אור מועבר ומצא את מישור המוקד העצבי דרך העיניים.
- הפעל את תוכנת הלייזר וחבר אותה לתוכנת בקרת הלייזר. הגדר את התאורה לשדה רחב ובחר את המטרה (מומלץ 100x 1.49 NA TIRF). הגדר את מקדם השבירה של הדגימה (תאים ~1.38). כוונן את עוצמת הלייזר על ידי ביטול הסימון של "TTL" (Transistor-Transistor Logic) עבור לייזר 491 ננומטר. התאימו את המחוון ל- 100 ולאחר מכן הורידו אותו בחזרה לערך שבין 20% ל- 40%. סמנו שוב את "TTL".
- התמקד שוב בדגימה בתאורת אור מועברת. עבור אל תוכנת הדמיה, בחר תאורת לייזר של 491 ננומטר ופתח את התריס. כוונן בעדינות את נקודת המוקד של הלייזר על התקרה ומרכז אותה למרכז דיאפרגמת השדה הסגור כשהמעבה הוסר. הנח את המעבה הפוך על הספסל האופטי כדי לא לשרוט את העדשה.
- החלף את הקבל, עבור לתוכנת TIRF והגדר את עומק החדירה (PD) ל-110 ננומטר. לאחר מכן, עבור מתאורת שדה רחב למצב תאורת TIRF להדמיה.
- מצא תאים המבטאים חלבון ממברנה 2 (VAMP2)-פלורין הקשורים לשלפוחית דרך העיניים באמצעות אפיפלואורסצנציה רחבה עם מקור האור האפיפלואורסצנטי.
- התאם את פרמטרי ההדמיה (זמן חשיפה, רווח ועוצמת לייזר) כדי למקסם את יחס האות לרעש ואת הטווח הדינמי באמצעות זמן החשיפה המינימלי ועוצמת הלייזר כדי להפחית פוטו-הלבנה ופוטוטוקסיות (לדוגמה, חשיפה בין 50 - 100 msec, עם רווח של 15 - 30 בעוצמת לייזר מקסימלית של 30%).
- הגדר מיקוד אוטומטי רציף לכל תא. רכוש ערכת תמונות דולג זמן עם רכישה המתרחשת כל 0.5 שניות למשך 5 דקות. למצב מגורה netrin-1, הוסף 500 ננוגרם/מ"ל netrin-1 לצלחת התאים במכסה זרימה למינרית והחזיר את המנה לחממה למשך שעה אחת לפני ההדמיה.