הדמיה של רשתות עצביות וכלי דם בעובר תרנגולת

תקציר

מקור: Delalande, J., et.al. תיוג כפול של תאי פסגה עצבית וכלי דם בתוך עוברי עוף באמצעות השתלת צינור עצבי^{של אפרוח GFP} והזרקת צבע קרבוציאנין DiI. J. Vis. Exp. (2015)

סרטון זה מדגים השתלה של צינור עצבי תורם המסומן ב-GFP מעובר עוף טרנסגני מותאם שלב לעובר מקבל ברמה של סומיטים 1 עד 7, ולאחר מכן תיוג כלי דם באמצעות צבע פלואורסצנטי ליפופיל. הגישה המשולבת מאפשרת הדמיה ישירה של העובר תחת מיקרוסקופ סטריאופלואורסצנטי, ומאפשרת לחקור את אינטגרציית השתלים העצביים והתפתחות רשת כלי הדם בביצה.

פרוטוקול

כל ההליכים הכוללים מודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ומועצת הביקורת הווטרינרית של JoVE.

1. השתלת הרקמה

1. בעזרת מיקרו-פיפטה מזכוכית, העבירו בזהירות את הצינור העצבי המנותח מזכוכית השעון לעובר המארח. מקם את הצינור העצבי בכיוון הקדמי-אחורי הנכון ודחף בעדינות את האקספלנט הסמוך לאזור הכריתה של מארח הגוזל באמצעות המיקרו-אזמל. השאירו שבר קטן של אקטודרם מחובר למשטח הגב או על ידי חיתוך חריץ קטן פנימה כדי לזהות את כיוון הצינור העצבי.
   1. במידת הצורך, השתמש במיקרו-אזמל כדי לקצץ את האקספלנט לגודל המדויק של האזור שנכרת.
2. הנח בעדינות את הצינור העצבי לתוך האזור המנותק ומקם אותו כך שהצד הגבי יהיה מכוון נכון. השתמש במיקרו-פיפטה מזכוכית, המותקנת על צינור פה, כדי להסיר PBS ו/או נוזל המקיף את השתל. זה עוזר לרקמות התורם והמארח להיצמד והשתל להתבסס.
3. אטום את החלון כולו עם סרט שקוף ברוחב 24 מ"מ כדי למנוע התייבשות וזיהום.
4. סמנו את העובר הכימרי על ידי סימון בעיפרון על קליפת הביצה ורשמו את מספרו בספר המעבדה. מחזירים את הביצה לחממה להמשך התפתחות.

2. הזרקת DiI לכלי הדם של העובר המארח

1. בנקודת הזמן הרצויה לניסוי (כאן, 3 - 10 ימים לאחר מכן), שלף את העובר הכימרי מהאינקובטור והסר את הסרט השקוף באמצעות מספריים ישרים כדי לקבל גישה לעובר בתוך הביצית.
2. במידת הצורך, הגדל את החלון בקליפה בעזרת המספריים. היזהר לא לפגוע בקרום הכוריואלנטואי אם הוא מחובר לקליפה, מה שיגרום לדימום ויסכן את תיוג כלי הדם.
3. בחר וריד נגיש על החלמון וודא שזרימת הדם מופנית לכיוון העובר. בחר נקודת הסתעפות של אחד מוורידי הוויטלין (איור 1B, C).
   הערה: ב-E6.5 - E7.5, ייתכן שיהיה צורך להזיז בעדינות את הממברנה הכוריו-אלנטואית הצידה עם פינצטה כדי לגשת לוורידי החלמון. לאחר E8.5, האפשרות היחידה היא להזריק לאחד מוורידי הממברנה הכוריואלנטואית מכיוון שבשלב זה, הממברנה הכוריו-אלנטואית מכסה את העובר במלואו.
4. הסר את קרום הוויטלין מעל נקודת ההזרקה שנבחרה באמצעות שתי פינצטות Dumont #5 על ידי קריעה בכיוונים מנוגדים.
5. שברו מחט זכוכית משוכה באמצעות Dumont #5 והתאימו את הקוטר שלה לגודל המשוער של הווריד לפני הטעינה עם CellTracker CM-DiI. הכינו את תמיסת מלאי ה-DiI ב-40 מיקרוגרם/מיקרוליטר ב-DMSO ואחסנו ב-20 מעלות צלזיוס. הכן את תמיסת העבודה ב-0.3 M סוכרוז/PBS בריכוז של 4 מיקרוגרם/מיקרוליטר.
   1. שאפו בין 5 - 10 מיקרוליטר של DiI ב-0.3 M סוכרוז/PBS לתוך המחט באמצעות יניקה עם צינור פה. עוברים מבוגרים עשויים לדרוש עד 25 מיקרוליטר או יותר. מ-E8.5, לעוברים יש ורידים גדולים ושריריים יותר, שייתכן שיהיה צורך להחזיק אותם במקומם עם Dumont #5 לפני שהם דוקרים עם מחט הזכוכית העמוסה ב-DiI.
6. הכנס במהירות את המחט לווריד ונשוף בהתמדה עם צינור הפה כדי לאפשר ל-DiI להצטרף לזרימת הדם לאט מבלי ליצור קריש דם. לחלופין, השתמש במזרק לחץ לאספקת DiI.

תוצאות

איור 1. הזרקת DiI תוך ורידית. (א) מכשירים מומלצים: א) טיפת CellTracker CM-DiI על פרפילם, ב) מחט הזרקת זכוכית משוכה, ג) צינור פה. (B) דיאגרמה סכמטית של הזרקת DiI תוך ורידית לעובר אפרוח כימרי E4. (C) בהזרקה תוך ו...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
ביצי אפרוח מופרות	הנרי סטיוארט ושות', לאות', בריטניה
ביצי אפרוח מופרות GFP	מתקן העוף הטרנסגני, מכון רוזלין, ביצת אוניברסיטת אדינבורו
חממה (Profi-H Hatcher)	ליון טכנולוגיות, קליפורניה, ארה"ב	910-033
חממה 14C	אינקובטור מקורר מדויק, Leec Ltd., נוטינגהאם, בריטניה	דגם LT2
סטריאו-מיקרוסקופ	LEICA	דגם MZ 12.5
מצלמה דיגיטלית	LEICA	DC500
תוכנת רכישת תמונות	LEICA	IM50
מקור אור קר הלוגן צוואר אווז	Advanced Imaging Concepts, Inc	KL 1500 LCD
צינור פה	SIGMA - ALDRICH	A5177
פיפטות העברה, פוליאתילן	SIGMA - ALDRICH	Z350796
Dumont #5 מלקחיים	Fine Science Tools	11251-30
סיכות דקות	כלי	מדע עדינים26002-15
מלקחיים של Dumont AA, כלי	מדע עדינים	Inox 11210-10
Sellotape (שקוף, רוחב 24 מ"מ)	כל ספק
CellTracker CM-DiI	בדיקות מולקולריות	C-7001
נימי זכוכית Borosillicate, קיר דק ללא נימה	מכשיר הרווארד	PY8 30-0035

מצופים אפוקסי