הדמיה בזמן אמת במבחנה של הסתעפות אקסונלית בנוירונים בקליפת המוח של עכבר

במאמר זה

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מקור: Winkle, C. C., et al. שימוש במתודולוגיות משולבות להגדרת תפקיד אספקת קרום הפלזמה במהלך הסתעפות אקסון ומורפוגנזה עצבית. J. Vis. Exp. (2016)

סרטון זה מדגים טכניקת הדמיה חיה באמצעות מיקרוסקופ ניגודיות הפרעות דיפרנציאלית (DIC) כדי לצפות בהסתעפות אקסונלית בזמן אמת בנוירונים בקליפת המוח. סרטוני זמן-lapse לוכדים את ההשפעות של טיפול ב-netrin-1, מולקולת איתות הגורמת לאקסוציטוזיס מקומי וסידורים מחדש של שלד התא באקסונים. תהליכים אלה יוזמים בליטות ממברנה, המתפתחות לענפים אקסונליים בוגרים, ומספקים תובנות לגבי התפתחות עצבית.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. מיקרוסקופיה של ניגודיות הפרעות דיפרנציאליות (DIC) של הסתעפות אקסון

הערה: בעוד שפרוטוקול זה משתמש ב-DIC, ניתן להשתמש בשיטות מיקרוסקופיה אחרות של אור מועבר לאותן מטרות (לדוגמה: ניגודיות פאזה).

לאחר יומיים במבחנה (DIV), הנח צלחת הדמיה עם תחתית זכוכית המכילה נוירונים לא מועברים בתא סביבתי מחומם מראש כדי לשמור על סביבה לחה עם 5% CO2 ו-37 מעלות צלזיוס. השתמש במיקרוסקופ המצויד בעדשת אובייקטיבית DIC עם צמצם מספרי 1.4 (NA) ומעבה NA גבוה לאיכות התמונה והרזולוציה הטובות ביותר.
כוונן את מישור המוקד כדי למצוא נוירונים דרך העיניים באמצעות תאורת אור מועברת.
באמצעות פונקציית רכישת ריבוי אזורים בתוכנת הדמיה, מצא ושמור את מיקומי ה-XYZ של לפחות 6 תאים. מקם את הבמה כך שתאי עצב מעניינים יתאימו לשדה הראייה לקבלת התוצאות הטובות ביותר.
1. עורר עם 250 ננוגרם/מ"ל netrin-1 ולחץ על 'התחל רכישת אזורים מרובים'. קבל תמונות ברצף בכל מיקום כל 20 שניות למשך 24 שעות, תוך השהיית הרכישה ומיקוד מחדש לפי הצורך.
סקור תמונות בתוכנת הדמיה באמצעות שם הקובץ 'אפליקציות>סקירת נתונים רב-ממדיים>פתיחה'. זהה ענפי אקסון יציבים (באורך 20 מיקרומטר) שנוצרים במהלך סשן ההדמיה. השתמש בכלי ציור הקו כדי למדוד ענף אקסון יציב מבסיס האקסון ועד לקצה כדי להבטיח עמידה בהסמכת האורך של 20 מיקרומטר.
1. בגיליון אלקטרוני, רשום את מספר המסגרת לאחר גירוי נטרין כאשר בליטות הממברנה מתחילות באזורים שבהם נוצרים ענפים מאוחר יותר, כמו גם את מספר המסגרת לאחר גירוי נטרין כאשר ענפים מתהווים מגיעים לאורך של 20 מיקרומטר.
2. הכפל את מספר המסגרות בין בליטה להיווצרות ענף ב-20 שניות כדי לחשב את זמן ההיווצרות לכל ענף.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
35mm כלי הדמיה של תאים חיים תחתונים מזכוכית			יש לצבוע ב-1mg/mL Poly-d-lysine ולשטוף לפני ציפוי התאים
אולימפוס IX81-ZDC2 מיקרוסקופ הפוך	אולימפוס
למבדה LS קסנון מנורת	סאטר מכשירים החברה
סביבתי שלב עליון חממה	Tokai להיט
100x 1.49 NA TIRF אובייקטיביה	אולימפוס
אנדור iXon EM-CCD	אנדור
אודיסיאה Licor מערכת הדמיה אינפרא אדום	LI-COR	Odyssey CL-X	משמש עבור סריקת כתמים
חבילת תוכנת סטודיו תמונה	LI-COR		משמשת לסריקה במערכת האינפרא אדום של אודיסיאה; Image studio lite המשמש לניתוח לא מקוון של כתמים
Metamorph for Olympus	Molecular devices, LLC	גרסה 7.7.6.0	תוכנה המשמשת לכל ההדמיה וניתוח של תוכנת בקרת DIC TIMELAPSE
CELL TIRF	אולימפוס		המשמשת לשליטה בלייזרים להדמיית TIRF
פיג'י (תמונה J)	NIH	ImageJ גרסה 1.49t
60x תוכנית אפוכרומט 1.4 NA מטרה	אולימפוס
40x 1.4 NA תוכנית אפוכרומט אובייקטיבית	אולימפוס
מדיה נוירובזאלית	GIBCO	21103-049	פתרון בסיס הן למדיה נטולת סרום והן למרווה טריפסין
תוסף B27	GIBCO	17504-044	500 מ"ל/50 מ"ל מדיה ללא סרום ומדיה מרווה טריפסין
L-גלוטמין		35050-061	1mL/50mLs מדיה ללא סרום
סרום בקר	עוברי Corning/CELLGRO	35-010-CV
תמיסת המלח המאוזנת של האנק (HBSS)	Corning/CELLGRO	20-021-CV
פולי-D-ליזין	סיגמא	p-7886

תוכנת

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

מאמרים קשורים