הדמיה דו-פוטונית in vivo של דינמיקת מיקרוגליה בהיפוקמפוס העכבר

תקציר

מקור: Kamei, R., et. al., In vivo Chronic Two-Photon Imaging of Microglia in the Mouse Hippocampus. J. Vis. Exp. (2022)

הסרטון מדגים את תהליך ההתקנה וההדמיה של מיקרוסקופיה דו-פוטונית in vivo של דינמיקת מיקרוגליה בהיפוקמפוס CA1 (Cornu ammonis 1) ובפיתול המשונן, מה שמבטיח יישור אופטי אופטי והערכת שלמות מבנית.

פרוטוקול

כל ההליכים הכוללים מודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ומועצת הביקורת הווטרינרית של JoVE.

1. in vivo, הדמיה דו-פוטונית כרונית של מיקרוגליה באמצעות עכברי CX3CR1-GFP

1. לאחר השראת הרדמה, שטפו את החלק הפנימי של צינור המתכת במי מלח סטריליים כדי להסיר פסולת. ודאו שהמכתשית הלבנה של ההיפוקמפוס נראית מבעד לזכוכית (איור 1A) ושאין סיבוכים, כמו למשל דימום לאחר הניתוח.
2. הגדר את העכבר מתחת למיקרוסקופ שני הפוטונים בשלבים הבאים:
   1. הנח את העכבר במכשיר מחזיק הראש מתחת לעדשת האובייקט של מיקרוסקופ שני הפוטונים ועל ה-XY הממונע tage. השתמש בכרית חימום לתמיכה תרמית. עקוב והתאם את עומק ההרדמה, מכיוון שבדיקת איכות זו עשויה להימשך עד 30 דקות. הערה: מומלצת עדשת אובייקט טבילה במים עם מרחק עבודה (WD) ארוך מ-3 מ"מ וצמצם מספרי גבוה (NA). צווארון תיקון של עדשת האובייקט יכול לשפר את הרזולוציה על ידי פיצוי על אי התאמה של מקדם השבירה בין הזכוכית לביו-חומרים.
   2. מלאו את החלל בין הזכוכית לעדשת האובייקט במים, תוך הקפדה מיוחדת על מניעת בועות אוויר. במידת הצורך, הרחב את שטח לוחית המתכת באמצעות סרט פלסטיק, המכיל יותר מים, כדי לכסות את כל העדשה הקדמית של המטרה.
   3. הפעל לייזר פועם פמטו-שנייה באורך גל של 920 ננומטר לעירור הגשושיות הפלואורסצנטיות המתבטאות במוח והפעל תוכנת רכישת תמונה.
   4. כוונן את המיקוד ל-CA1 (Cornu Ammonis 1) באמצעות הממונע tagומערכת המיקוד הממונעת. מקם את מבנה המטרה בהנחיית הקרינה הנפלטת מפרנכימת המוח והאור המוחזר מקצה צינור המתכת תחת תאורה רציפה על ידי הלייזר הפועם.
   5. מדוד את עומק פרנכימת המוח הנוגעת בתחתית הזכוכית על ידי התאמת המיקוד עם מערכת המיקוד הממונעת. השווה את העומקים במיקומים אופקיים שונים כדי לשפוט את יישור תחתית הזכוכית ומישור ההדמיה.
      1. כוונן את זווית ראש העכבר על-ידי הטיית התקן אחיזת הראש עד שתחתית הזכוכית מוגדרת כמקבילה למישור ההדמיה.
   6. התאם את צווארון התיקון של המטרה כדי להשיג את הרזולוציה הגבוהה ביותר בעומק מבנה היעד ב-CA1.
3. בדקו את האיכות והעוצמה של תמונות שהתקבלו על-ידי עירור דו-פוטוני של ההיפוקמפוס (איור 1B).
   הערה: הידרדרות בתמונה מצביעה על נוכחות של נזק לרקמות בתוך המוח.
4. ודא שמיקרוגליה כבר התאוששה מהמורפולוגיה המסועפת שלה (איור 1C).
   הערה: נתוני ההדמיה של מיקרוגליה מצביעים על כך שנדרשים לפחות 3-4 שבועות כדי שהמיקרוגליה תחזור למצבה הבסיסי.
5. בצע הדמיה in vivo בכל שכבות ה-CA1 למטרה הספציפית של הניסוי.

תוצאות

איור 1: הדמיה in vivo של מיקרוגליה בעכברי CX3CR1-GFP בשלב הכרוני. (א) המראה המייצג של החלון המושתל בגב הימני CA1 (Cornu Ammonis 1) בשלב הכרוני. דרך תחתית הזכוכית נצפים בבירור הסיבים הלב...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
לייזר פועם פמטו-שנייה	ספקטרה-פיזיקה	MaiTai Deep See	A Ti:Sapphire לייזר המשמש באורך גל של 920 ננומטר.
מיקרוסקופ דו-פוטוני	Nikon	A1R MP+	מיקרוסקופ להדמיית CA1.
עדשת אובייקט להדמיה דו-פוטונית	אולימפוס	XLPLN25XSVMP	25× אובייקט עם מרחק עבודה ארוך, צמצם מספרי גבוה וצווארון תיקון
לוחות אלומיניום	Narishige	CP-1	לוחות עשויים אלמינום לקיבוע ראש.
כיסויי זכוכית עגולים	Matsunami Glass	3φ No.1	כיסויים מודבקים לצינורות נירוסטה.
עכברי CX3CR1-GFP	מעבדת ג'קסון	8451	עכברים טרנסגניים להדמיית מיקרוגליה.
צינורות נירוסטה גליליים	MORISHITA	בהתאמה אישית	להשתלה. קוטר חיצוני 3.0 מ"מ, קוטר פנימי 2.8 מ"מ, גובה 1.7 מ"מ.
צמנט שרף דנטלי (סופר-בונד C&B)	סאן מדיקל	204610555	צמנט דנטלי.
מכשיר החזקת ראש	Narishige	MAG-2	מכשיר החזקת הראש של עכברים עם מכווני זווית
כרית חימום	מרכז המחקר הביולוגי	BWT-100A ו-HB-10	כלים למתן תמיכה תרמית לעכבר במהלך הניתוח.
כרית חימום	ALA Scientific	HEATINGPAD-1 ו-Hot-1	Tools כדי לספק תמיכה תרמית לעכבר בהתקן החזקת הראש.
קטמין (קטלר)	Daiichi Sankyo Company	S9-001665	הרדמה במהלך ניתוח.
משחה עיניים	Sato Pharmaceutical		משמש למניעת יובש בעיניים במהלך ניתוח.
תמיסת קרצוף פובידון-יוד	Meiji Seika Pharma	2612701Q1137	משמש לחיטוי אתר הניתוח.
מיקרוסקופים סטריאו מיקרוסקופים	Leica Microsystems	S8 APO	לניתוח.
תמיסת מלח סטרילית	Otsuka Pharmaceutical Factory	3311401A2026	תמיסת כביסה במהלך הניתוח.
כרית סטרילית עמידה למים	AS ONE	8-5945-01	פלטפורמה כירורגית.
קסילזין (סלקטל 2%)	באייר		הרדמה במהלך הניתוח.

צינורות מתכת