העברת תאי גזע מזנכימליים תוך-אף במודל עכבר של פגיעה מוחית טראומטית

כל ההליכים הכוללים מודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ומועצת הביקורת הווטרינרית של JoVE.

1. תיוג של תאי גזע מזנכימליים (MSCs) עם ננו-חלקיקי תחמוצת ברזל סופר-פרמגנטית (SPIO)

1. כדי לתייג MSCs עם SPIO, הוסף 6 מ"ל של אמצעי תיוג (25 מיקרוגרם/מ"ל של SPIO במדיום הנשר המותאם של Dulbecco (DMEM) ללא סרום בקר עוברי (FBS)) לבקבוק T75 המכיל MSCs (מפגש של 80%).
2. דגרו את התאים עם אמצעי התיוג באינקובטור CO₂ (37 מעלות צלזיוס, 5% CO₂) ללא טלטול. לאחר 24 שעות, הסר בעדינות את אמצעי התיוג באמצעות פיפטה סטרילית של פסטר עם קצה פלסטיק המחובר לשואב. שטפו את התאים חד-שכבתיים פעמיים עם 6 מ"ל של מי מלח עם חוצץ פוספט (PBS) כדי להסיר עקבות של SPIO לא מופנם.
   1. כדי לקבוע אם התאים סומנו בהצלחה, בדוק את התאים המסומנים תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי או מיקרוסקופ קונפוקלי אם ה-SPIO מתויג עם פלואורופור (כלומר, כמו אלה המשמשים כאן; איור 1B, C).
3. קצור תאים דבקים על ידי טיפול ב -3 מ"ל טריפסין ודגר ב -37 מעלות צלזיוס. לאחר 5 דקות של דגירה, הוסף 7 מ"ל של מדיית DMEM מחוממת מראש עם 10% FBS (v/v) כדי לנטרל את הטריפסין. אוספים את תרחיף התאים באמצעות פיפטה לצינור חרוטי של 15 מ"ל.
4. צנטריפוגה את תרחיף התא ב-300 x גרם למשך 5 דקות. השליכו את הסופרנטנט והשעו מחדש את כדור התא ב-PBS. ספרו את התאים הקיימים באמצעות צבע כחול טריפן והמוציטומטר.
   הערה: כדורית התא של התאים המסומנים תופיע כצבע כהה עקב העמסת ברזל (איור 1D). פרוטוקול זה רלוונטי לתיוג MSC והדמיית תהודה מגנטית (MRI). הנוהל לתיוג MSC עבר אופטימיזציה בעבר, ורק השלבים להכנת MSCs מסומנים למעקב in vivo כלולים כאן, מכיוון שמעקב in vivo הוא המוקד. הפרוטוקול לתרבית ותיוג של סוגי תאים אחרים צריך להיות אופטימלי על ידי החוקר.
5. התאם את ריכוז התאים באמצעות PBS ל-150,000 תאים (או מספר המביא לאות MRI מספיק) ב-18 מיקרוליטר של PBS (או הנפח הכולל שישמש בהליך המסירה התוך-אף).
   הערה: הבחין כי ריכוז תאים גבוה מ-150,000 תאים/18 מיקרוליטר של PBS מוביל לצבירת תאים, מה שעלול להשפיע על יעילות האספקה התוך-אף. אם יש צורך במספר גבוה יותר של תאים לאספקה תוך-אף, הגדל את הנפח הכולל של תרחיף התאים והגדל את מספר המינונים התוך-אף, מכיוון שמתן תוך-אף הוא הליך לא פולשני, וניתן לבצע מינונים מרובים.

2. פגיעה מבוקרת בקליפת המוח (CCI)

הערה: בפרוטוקול זה, עכברי C57 BL/6 זכרים (בני 7-8 שבועות) הוחזקו במחזור אור/חושך של 12/12 שעות עם גישה אד ליביטום למזון ומים.

1. כדי להכין כל עכבר לפגיעה ב-CCI, יש לתת את קוקטייל ההרדמה זולאזפאם (50 מ"ג/ק"ג) וקסילזין (20 מ"ג/ק"ג) באמצעות הזרקה תוך-צפקית (i.p.) (1 מ"ל/ק"ג). ודא שעומק ההרדמה מספיק על ידי היעדר תגובת צביטה בבהונות. לחלופין, הנח את העכבר בתא המסופק עם 2%-4% איזופלורן למשך 60 שניות.
2. לגלח את הפרווה של משטח הגב של הגולגולת בין האוזניים באמצעות קוצץ שיער אלקטרוני. נקו את האזור המגולח מספר פעמים בעזרת צמר גפן סטרילי ספוג ביוד. השתמש במקלון צמר גפן ספוג באתנול 70% כדי לנקות את היוד.
3. הנח את העכבר המורדם במסגרת הסטריאוטקטית ואבטח את העכבר באמצעות מוטות אוזניים ומוטות אף. בצע חתך אמצע סגיטלי (כ -2.5 ס"מ) בעור המגולח באמצעות מספריים סטריליים כדי לגשת אל פני הגולגולת.
4. הסר את הרקמה על העצם באמצעות כרית כותנה כדי לחשוף את הגולגולת. נקו את משטח הגולגולת באמצעות צמר גפן ספוג במי חמצן 3% (H₂O₂) למשך 10 שניות, ולאחר מכן נקו אותו עם כרית כותנה יבשה.
   הערה: כעת ניתן לזהות בקלות את תפרי הגולגולת וגם ברגמה ולמבדה.
5. זהה את הקואורדינטות הנבחרות על פני הגולגולת עבור הפגיעה ב-CCI וצייר עיגול (קוטר 4 מ"מ) סביב הקואורדינטות באמצעות עיפרון או טוש מתאים.
   הערה: בפרוטוקול זה, הקואורדינטות באנטרופוסטריור (AP) -2.0 מ"מ ומדיולטרלי (ML) +1.5 מ"מ שימשו לאינדוקציה של CCI.
6. השתמש במקדחה ובבור עגול (קוטר 0.5 מ"מ) כדי לדלל את הגולגולת בעיגול המסומן. הימנע מהפעלת לחץ בזמן הקידוח, מכיוון שקידוח דרך העצם עלול לגרום נזק לפרנכימה המוחית. נקה אבק עצמות באמצעות צמר גפן נקי ויבש.
7. הסר בעדינות את דש העצם באמצעות מלקחיים עדינים סטריליים כדי לחשוף את הדורה מאטר תוך שמירה על שלמותו. הסר את העכבר מהמסגרת הסטריאוטקטית ששימשה להכנה לפני פציעה והנח אותו במסגרת הסטריאוטקטית של מכשיר ה-CCI.
8. ייצב את ראש העכבר באמצעות מוטות האוזניים ומוטות האף. ודא שראש העכבר מפולס בכיוון הרוסטרלי-זנבי והתאם את מוטות האף, במידת הצורך.
9. עקוב אחר ההוראות שעל תיבת הבקרה כדי לאפס את קצה הפגיעה למשטח קליפת המוח החשוף. ודא שקצה הפגיעה מיושר ישירות מעל קואורדינטות קליפת המוח הרצויות לפגיעה באמצעות גלגלי הבקרה X ו-Y בבסיס הפגיעה.
10. הגדר את פרמטרי הניסוי באמצעות תיבת הבקרה במהירות של 5 מ' לשנייה, זמן שהייה של 250 אלפיות השנייה ועומק פציעה של 1 מ"מ כדי לגרום לפציעה קלה בעכבר.
11. לגרום לפציעה על ידי לחיצה על כפתור "השפעה" בתיבת הבקרה. ספוג כל דימום המתרחש באמצעות צמר גפן סטרילי.
12. הסר את העכבר מהמסגרת הסטריאוטקטית וסגור את החתך באמצעות תפרי משי כירורגיים. אל תשתמש בקליפסים מתכתיים כדי לסגור את אתר הניתוח, מכיוון שהעכבר יהיה נתון לשדה מגנטי ל-MRI.
13. מרחו אנטיביוטיקה מקומית (בציטראצין ניאומיצין) על אתר הניתוח כדי למנוע זיהומים. השאר את העכבר על כרית החימום ופקח עליו מקרוב בשלב ההתאוששות.
14. יש לתת קטופרופן (2.5 מ"ג/ק"ג, IP) מדי יום במשך 3 ימים לאחר הניתוח, אלא אם כן מתן הקטופרופן סותר את יעדי המחקר.

3. אספקה תוך אף

1. יום אחד לאחר השראת CCI, יש לתת את קוקטייל ההרדמה זולאזפאם (50 מ"ג/ק"ג) וקסילזין (20 מ"ג/ק"ג) באמצעות הזרקת i.p. ודא שהעכבר מורדם עמוק על ידי היעדר תגובת צביטה בבהונות.
2. הכן את העכבר לאספקה תוך-אפית של MSCs על ידי טיפול בהיאלורונידאז.
   1. תפוס את קשקוש העכבר וסובב את גבו בחוזקה תוך כדי שיתוק הגולגולת. הנח את קצה הפיפטה המכילה היאלורונידאז ב-PBS סטרילי (4 U/μL) ליד נחיר העכבר בזווית של 45°.
   2. יש לתת 3 מיקרוליטר של תרחיף היאלורונידאז בכל נחיר. שמור את העכבר ללא תנועה ופונה כלפי מעלה על משטח נקי למשך 5 דקות. חזור על הטיפול בהיאלורונידאז פי 4 (סה"כ תרחיף היאלורונידאז 100 U).
3. לאחר טיפול בהיאלורונידאז, שמור את העכבר המטופל על כרית נקייה עם הפנים כלפי מעלה למשך 30 דקות.
4. כדי להעביר MSCs למוח, החזיקו את העכבר בחוזקה, כמתואר בשלב 3.2.1. יש לתת 3 מיקרוליטר/נחיר של מתלה MSC במרווח של 3 שניות. המשך להחזיק את העכבר באותו מצב למשך 30 שניות עד שהדגימה טיפה נעלמה לחלוטין.
   הערה: הימנע מהיווצרות בועות אוויר במהלך המתן.
5. חזור על המתן במרווח של 2 דקות עד 3x.
   הערה: המספר הכולל של התאים שיש להעביר הוא 150,000, כך שניתן לספק 18 מיקרוליטר של תרחיף התאים במינון של 3 מיקרוליטר לכל נחיר, פי 3 כל אחד.
6. החזירו את העכבר לכלוב שלו ועקבו אחריו מקרוב עד שיתאושש לחלוטין מההרדמה.

איור 1: תרשים זרימה סכמטי של הפרוטוקול ואישור במבחנה של קליטת SPIO על ידי MSCs. (A) MSCs הודגרו עם SPIO למשך 24 שעות לצורך תיוג. לאחר מכן, ה-MSCs המסומנים הועברו למודל עכבר TBI דרך נתיב תוך-אף (IN). MRI בנקודות זמן שונות בוצע כדי לעקוב אחר MSCs המסומנים אישור לתיוג מספיק של MSCs על ידי SPIO הושג על ידי (B) מיקרוסקופיה פלואורסצנטית ו-(C) מיקרוסקופיה קונפוקלית באמצעות ערוץ FITC מכיוון שננו-חלקיקי SPIO תויגו עם FITC. (D) כדורית התא של ה-MSCs המסומנים נראתה בצבע כהה עקב העמסת ברזל. FITC = פלואורסצאין איזותיוציאנט; SPIO = חלקיקים סופר-פרמגנטיים של תחמוצת ברזל; MSCs = תאי גזע מזנכימליים; MRI = הדמיית תהודה מגנטית; IN = תוך-אף; TBI = פגיעה מוחית טראומטית.