הדמיה של מעברי סידן מהירים בקצות עצבים של עכברים באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית

כל ההליכים הכוללים דגימות של בעלי חיים נבדקו ואושרו על ידי ועדת הביקורת האתית המתאימה לבעלי חיים.

נערכו ניסויים על תכשירים עצביים-שריריים מבודדים של levator auris longus (m. LAL) מהעכברים BALB/C (20-23 גרם, בני 2-3 חודשים).

1. הכנת תמיסות הצלצול והתיוק

1. הכינו את תמיסת הרינגר לשריר היונקים על ידי ערבוב המרכיבים הבאים: נתרן כלורי, NaCl (137 מ"מ), אשלגן כלורי, KCl (5 מ"מ), סידן כלורי, CaCl₂ (2 מ"מ), MgCl₂ (1 מ"מ), NaH₂PO₄ (1 מ"מ), NaHCO₃ (11.9 מ"מ) וגלוקוז (11 מ"מ). בעבוע דרך התמיסה עם 95% חמצן (O₂) ו-5% פחמן דו חמצני (CO₂) והתאם את ה-pH שלה ל-7.2-7.4 על ידי הוספת חומצה הידרוכלורית/נתרן הידרוקסיד (HCl/NaOH) במידת הצורך.
2. הכן את תמיסת העמסת הצבע.
   1. הכינו תמיסת חומצה 4-(2-הידרוקסיאתיל)-1-piperazineethanesulfonic (HEPES) (10 מ"מ) עם pH בטווח 7.2-7.4. 500 מיקרוגרם של צבע מסחרי מגיע בבקבוקון של 500 מיקרוליטר. ממיסים את הצבע ב-14 מיקרוליטר מתמיסת HEPES לקבלת ריכוז צבע של 30 מ"מ. מנערים היטב וצנטריפוגה עד להמסה מלאה.
   2. לדלל את התמיסה של מחוון Ca²⁺ עם תמיסת HEPES עד לריכוז של 1 מ"מ. שמור אותו במקפיא (-20 מעלות צלזיוס) והימנע מחשיפה לאור.

2. נוהל טעינת צבע

הערה: הליך טעינת הצבע מבוצע על פי פרוטוקול ההעמסה דרך גדם העצב, המותאם מהפרוטוקולים שפורסמו בעבר.

1. נתח את שריר LAL על פי נוהל הדיסקציה לתכשיר זה כמתואר בפרוטוקולים שפורסמו בעבר.
   1. מקבעים את הרקמה מתוחה מעט (לא יותר מ -30% מהאורך ההתחלתי) בצלחת הפטרי המצופה אלסטומר עם סיכות נירוסטה עדינות ומוסיפים את תמיסת רינגר עד שהשריר מכוסה במלואו.
      הערה: צלחת הפטרי מולאה מראש באלסטומר על פי הוראות היצרן (ראה טבלת חומרים).
2. הכן את פיפטת המילוי
   1. בעזרת מושך מיקרופיפטה (ראה טבלת חומרים), הכינו מיקרופיפטה עם קצה עדין וחד ככל האפשר עבור ההקלטות התוך תאיות. השתמש בנימים ללא חוטים פנימיים (1.5 מ"מ בקוטר חיצוני ו-0.86 או 1.10 מ"מ בקוטר פנימי).
   2. נתק את קצה המיקרופיפטה לאחר שהבקעת את המחודד עם חומר שוחק, והשאיר את הקצה פתוח לקוטר של כ -100 מיקרומטר. יש ללטש את הקצה באש כדי להגביל כאשר הקוטר הפנימי מתכווץ מ->80 מיקרומטר ל-12-13 מיקרומטר. חברו צינור סיליקון לצד אחד של פיפטת המילוי ומזרק (ללא מחט) בצד השני.
3. תחת סטריאומיקרוסקופ, מצא את המקום בו גזע העצב הופך לענפי עצב נפרדים. מניחים את פיפטת המילוי עם הצינור המותקן והמזרק על צלחת הפטרי באמצעות שעווה. הזז את קצה הפיפטה עד שהוא יעמוד מעל העצב.
4. בעזרת מספריים עדינים חותכים את העצב קרוב לסיב השריר ומשאירים חתיכה קטנה מגדם העצב באורך של כ -1 מ"מ. שאפו בעדינות את גדם העצב יחד עם תמיסת רינגר, מבלי לצבוט אותו, לתוך קצה פיפטת המילוי. הסר את צינור הסיליקון מפיפטת המילוי.
5. צייר כמות מסוימת מתמיסת טעינת הצבע (~0.3 מיקרוליטר) באמצעות מזרק עם נימה ארוכה. נפח זה מתאים לכ -3 ס"מ מהחוט.
   הערה: בתחילה, יש צורך ליצור נימה מקצה פיפטה בנפח 10 מיקרוליטר על ידי משיכת האש באמצעות אלכוהול lamp או מבער גז.
6. הכנס בעדינות את קצה החוט עם תמיסת הטעינה לתוך פיפטת המילוי. שחררו את התערובת ישירות על גדם העצב. דגרו את התכשיר בטמפרטורת החדר בחושך למשך 30 דקות.
7. לאחר מכן יש לשטוף את התכשיר בתמיסת רינגר טרייה ולדגור בחום של 25 מעלות צלזיוס עד שעתיים בכוס זכוכית עם תמיסת רינגר של 50 מ"ל (או יותר) (יש לכסות את התכשיר בתמיסה). במהלך תקופה זו, הצבע יגיע לסינפסות.

3. צילום וידאו במיקרוסקופיה קונפוקלית

הערה: רישום מעברי סידן מתבצע באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי לסריקת לייזר (LSCM) (ראה טבלת חומרים). כדי לרשום מעברי סידן מהירים, נעשה שימוש בפרוטוקול מקורי שאיפשר הקלטות של אותות ברזולוציה מרחבית וזמנית מספקת. המיקרוסקופ צויד במטרת טבילה במים פי 20 (צמצם מספרי של 1.00 (NA)). קו הלייזר של 488 ננומטר הוחלש לעוצמה של 10%, והפלואורסצנטיות של הפליטה נאספה מ-503 ל-558 ננומטר.

1. הרכיבו את התכשיר לתא הניסוי המצופה אלסטומר סיליקון וקבעו אותו, מתוח מעט, בעזרת סט מחטי מיקרו מפלדה. שטפו את התכשיר בהרחבה בתמיסה של רינגר.
   הערה: נעשה שימוש בתא ניסוי זלוף פשוט בהתאמה אישית עשוי זכוכית אורגנית כאשר תחתית התא מכוסה באלסטומר (שהוכן בהתאם להוראות היצרן; ראה טבלת חומרים). בתא יש צינור אספקת תמיסה. התמיסה נשאבת החוצה באמצעות מחט מזרק, המותקנת על מחזיק מגנטי (ראה טבלת חומרים). כתא ניסוי, ניתן להשתמש בצלחת פטרי (כמו זו המשמשת לדגירה של התכשיר), אך עם צינורות אספקה ויניקה מחוברים.
2. התקן אלקטרודת יניקה, שתשמש לגירוי העצב.
   הערה: הנח ותקן את האלקטרודה על ידי שעווה ליד האמבטיה. הזיזו את הקצה קרוב לגדם העצב ושאבו אותו לתוך האלקטרודה.
3. התקן את תא ההכנה על במת המיקרוסקופ והנח את אביזרי הכניסה והיציאה לתא.
4. כדי לחלחל את התכשיר, השתמש במערכת פשוטה המונעת על ידי זרימת כוח הכבידה. הפעל את משאבת יניקת הזלוף כדי להסיר את התמיסה העודפת.
5. חבר את אלקטרודת היניקה המגרה לממריץ חשמלי וודא שהתכווצויות שרירים מתרחשות לאחר הגירוי. ראה סעיפים 3.9-3.12 לתנאי גירוי והקלטה.
6. מלאו את מערכת הזלוף בתמיסת ה-Ringer עם d-tubocurarine (10 מיקרומטר).
   הערה: פתרון זה מסייע במניעת התכווצויות שרירים. חוסמים ספציפיים ל-D-tubocurarine או אלפא-בונגרוטוקסין של קולטני אצטילכולין ניקוטיניים על הממברנה הפוסט-סינפטית יחסמו באופן מלא או חלקי את התכווצויות השרירים50. כמו כן, למניעת התכווצויות שרירים, ניתן להשתמש בחוסמים ספציפיים של תעלות נתרן פוסט-סינפטיות כגון μ-קונוטוקסין GIIIB51.
7. הפעל את משאבת יניקת הזלוף והתחל לזלף את התכשיר עם תמיסת ה-Ringer המכילה d-tubocurarine.
8. הגדר פרמטרי הדמיה בתוכנת LSCM באופן הבא.
   1. בתוכנת LSCM (LAS AF; ראה טבלת חומרים), בחר אלקטרופיזיולוגיה.
      הערה: במצב זה, כאשר תמונה נלכדת בנקודת הזמן, דופק מסנכרן נשלח לסטימולטור בעזרת תיבת ההדק. זה מעורר יצירת פוטנציאל פעולה בתכשיר (איור 1; יחידת ממריץ).
   2. בחר מצב רכישה. להפעלת הסטימולטור באמצעות דופק הסנכרון של המיקרוסקופ, בהגדרות תפריט העבודה, בחר את הגדרות הטריגר. הגדר את השדה Trigger Out On Frame לערוץ out1.
   3. השתמש בהגדרות הבאות: מצב סריקה: XYT, תדירות סריקה: 1400 הרץ, גורם זום: 6.1, חור סיכה: פתוח לחלוטין. ודא שמצב X דו-כיווני עובר ברצף מופעל.
   4. הגדר זמן מינימלי ליצירת מסגרת ב-52 אלפיות השנייה ומסגרות שייאספו בסרטון גולמי ב-20 פריימים.
      הערה: הגדרות אלה מאפשרות לכידת תמונה ברזולוציה של 128 x 128 פיקסלים תוך צילום פריים בודד כל 52 אלפיות השנייה.
   5. הגדר את אורך גל העירור של לייזר הארגון ב-488 ננומטר עם 8% מהספק המוצא.

לחץ על כפתור מצב חי כדי לעבור למצב Live, שעוזר לקבל תצוגה מקדימה של מסופי העצבים העמוסים בצבע.

9. יחידת גירוי
   הערה: מכשיר זה מאפשר להגדיר פרמטרים זמניים של גירוי באמצעות תוכנת MATLAB.
   1. צור קובץ חדש, הדבק את הקוד מהמאמר הנ"ל בחלון הקוד של MatLab ושמור את הקובץ. לחץ על הפעל, כך שיופיע חלון עם פרמטרי גירוי. הגדר את זמן העיכוב ומשך הגירוי.
      הערה: העיכוב קובע את הרזולוציה הזמנית של האות הפלואורסצנטי המשוחזר. הדופק החשמלי של 0.2 אלפיות השנייה מתעכב ולאחר מכן נשלח ליחידת הבידוד. האחרון יוצר את המשרעת והקוטביות של הדופק המגרה ומבודד חשמלית את האובייקט הביולוגי מציוד ההקלטה.
   2. כדי לעורר את העצב, בחר משרעת על-מקסימלית של הדחף המגרה (25%-50% יותר מעוצמת הגירוי המקסימלית הדרושה להפעלת כל סיבי העצב).
      הערה: השיטה המוצגת מבוססת על אלגוריתם מיוחד להקלטת אותות פלואורסצנטיים מהירים בודדים באמצעות LSCM עם טאטא ממוזער. בכל שלב של האלגוריתם שפותח, האות הפלואורסצנטי המוקלט מוסט מהקודם במרווח זמן קצר יותר מטאטא המיקרוסקופ. הערך של משמרות זמן קובע את הרזולוציה הזמנית של האות הנדרש. מספר הצעדים (הזזות) באלגוריתם תלוי ברזולוציה הזמנית הנדרשת וברזולוציה הזמנית המקורית. בשיטת רישום זו, גירוי התכשיר מתבצע בתדר של 0.25 הרץ.
10. במצב Live, חפש את החזר ה-ROI וקבל את המיקוד הטוב ביותר. הפעל את תוכנת רכישת הנתונים.
11. העבר את ההשהיה על הממריץ ב-2 אלפיות השנייה פחות ביחס לערך הקודם והפעל את תוכנת רכישת הנתונים.
12. חזור על שלב 3.11 26 פעמים כדי לרכוש 26 רצפים, כאשר כל רצף הוסט ב-2 אלפיות השנייה מהקודם.

איור 1: הסכימה של מערך הניסוי. 1. מיקרוסקופ קונפוקלי לסריקת לייזר (LSCM). 2. מודול סנכרון של LSCM (תיבת טריגר). 3. ממריץ. 4. יחידת בידוד. 5. הדגימה הביולוגית. 6. אלקטרודת יניקה לגירוי חשמלי של עצבים. 7. מערכות זלוף (7a: מאגר פרפוזה, 7b: טפטפת, 7c: ווסת זרימה, 7d: בקבוק ואקום). החצים מצביעים על כיוון ההתפשטות של הדופק המסונכרן.