גירוי חשמלי טרנס-גולגולתי של קליפת המוח המוטורית בחולדה ערה

כל ההליכים הכוללים מודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ומועצת הביקורת הווטרינרית של JoVE.

1. הליך כירורגי: השתלת אלקטרודה בחזה

הערה: ניתן לדלג על שלב זה כאשר האלקטרודה הנגדית מונחת חיצונית על החזה המגולח בעזרת אפוד.

1. הניחו את המכרסם הנוטה (על החזה) על שולחן הניתוח.
   הערה: במקרה של הרדמה באינהלציה, שמור את חוטם החולדה ממוקם בפיית ההרדמה, והפחית עוד יותר את ריכוז האיזופלורן ל-1.5-2%.
2. יש לחטא את הקרקפת המגולחת בעזרת תרסיס חיטוי או בעזרת ספוגית ספוגה בחומר חיטוי (למשל, אתנול 70%) ולתת להתייבש באוויר. חזור על הפעולה פעמיים.
3. חותכים את העור עם אזמל בקו אחד מגובה העין הרוסטרלית לגובה האוזן האמצעית.
   הערה: זה מאפשר מנהור של כבל החיבור מאלקטרודת החזה המושתלת לכיוון החלק העליון של הראש והוא גם החיתוך הרצוי למיקום שקע האלקטרודה לגירוי זרם ישר (DCS).
4. סובב את החולדה למצב שכיבה, כך שהחזה ייחשף.
5. לחטא את עור החזה כמתואר בשלב 1.2.
6. הרם את העור הצדדי של החזה הימני בעזרת מלקחיים לרקמות וחתוך חור כפתור עם מספריים קטנים של כ-0.5 ס"מ מדיאלי מהבית השחי הימני. לאחר מכן, בצע חתך סגיטלי ישר בכיוון הגולגולת בעזרת המספריים.
7. צרו כיס תת עורי על ידי ניתוק א-טראומטי של העור משריר החזה העיקרי השמאלי. עשה זאת על ידי פתיחה חוזרת ונשנית של המספריים הקטנים (או על ידי צמר גפן ספוג במי מלח).
8. סובב את החיה בצד ימין שלה כדי לתעל את נתיב הכבל מהפינה העורפית השמאלית של עור הראש הפתוח לאורך הצוואר כדי לצאת לתוך כיס החזה על ידי חדירה לפאשיה השטחית באמצעות מלקחיים הומאוסטטיים.
9. פתח בזהירות את המלקחיים ההומאוסטטיים כדי לתפוס את קצה כבל האלקטרודה המחובר לאלקטרודת הפלטינה מבלי לאפשר לחוטים חדים לסטות מהדרך. משוך את הכבל דרך המנהרה עד שהאלקטרודה נכנסת לשקית, מכוונת עם נקודת ההלחמה לכיוון הגפה האחורית השמאלית של המכרסם. סובב את המכרסם בחזרה למצב השכיבה.
10. תקן את צלחת הפלטינה עם תפר קלוע סינטטי סטרילי, שאינו נספג לפאשיה החזה בשני חורי הפינה המנוגדים (מומלץ 4-5 קשרים ליציבות).
11. באופן דומה חבר את הכבל לפאשיה על ידי קשר רופף, ויוצר לולאה קלה לפני הכניסה למנהרת הרקמות.
12. סגור את העור עם 3-4 תפרים עוריים, תלוי בגודל החיתוך (ניתן להשתמש באותו חומר תפר לאלקטרודה ולכבל).

2. הליך כירורגי: מיקום שקע הגירוי המוחי החשמלי הטרנס-גולגולתי האפיקרניאלי (tES)

1. הנח את החיה במסגרת סטריאוטקטית.
   הערה: אם משתמשים בהרדמה באינהלציה, הורד את ריכוז חומר ההרדמה לזרימת איזופלורן תחזוקתית של ~1.5-1%, מותאם לרפלקס צביטת הבוהן ולדפוס הנשימה.
2. חיטוי הקרקפת המגולחת כמתואר בשלב 1.2.
3. חותכים את העור עם אזמל בקו אחד מגובה העין הרוסטרלית לגובה האוזן האמצעית.
   הערה: אם בוצע מיקום אלקטרודות החזה, שלבים 2.2 ו-2.3 כבר בוצעו.
4. מגרדים את הפריאוסטאום (רקמת חיבור על הגולגולת) לצדדים בעזרת האזמל ומנגבים היטב בעזרת צמר גפן. קבע את רקמת החיבור ב-4 פינות החתך בעזרת מלחציים של בולדוג ותן להם לתלות לרוחב כדי לשמור על שדה הניתוח פתוח.
5. מרחו 0.9% מלח לניקוי משטח העצם והרקמות בעזרת צמר גפן. לאחר מכן, נקו את משטח העצם עם 3% H₂O₂. הימנע ממגע עם הרקמה. בכך מנקים את העצם בצורה יסודית יותר ודימום קל מהעצם ייפסק. כמו כן, שאריות של הפריאוסטאום נראות לעין. הסר את השאריות הללו בעזרת צמר גפן המפעיל לחץ מתון.
   הערה: הסרת שאריות הפריאוסטאום תגביר את ההדבקה והעמידות של שקע ה-tES המודבק על העצם.
   1. במקרה של דימום בלתי ניתן לעצירה, השתמש במקדח עצם וגע בו במשך 1-3 שניות עם לחץ קל על העצם. הליך מכני זה יעצור, ברוב המקרים, את הדימום ללא חימום משמעותי. לעולם אל תשתמש בצריבה חשמלית על העצם; אפילו מריחה קצרה תגרום לנזק לרקמת המוח (יש להשתמש בצריבה חשמלית אך ורק לדימום מרקמת הפצע).
6. מכיוון שברגי קיבוע ישפרו את הדבקות בהגדרה, בחר מקדחה המתאימה לגודל הבורג. הנח שני חורי קוצים על שתי לוחות עצם שונים על ידי קידוח מקדים עם מקדחה ידנית ולאחר מכן על ידי הפעלת לחץ אנכי קל עם מקדחת העצם. הימנע מקרבה למיקום הרצוי של שקע ה-tES, מכיוון שהוא עלול להפריע להברגה של האלקטרודה (למשל, עבור tES קליפת המוח הראשונית השמאלית, בחר מיקום בורג פריאטלי קדמי ואחורי ימני).
7. במקרה של אלקטרודה נגדית מושתלת, יש לחפור חור שלישי הממוקם בעצם הקודקודית האחורית הימנית לקיבוע עתידי של הכבל המנהרה.
8. הנח את ברגי הפלסטיק בחורי הקוצים והברג עד שמורגש החיכוך הראשון. לאחר מכן בצע שלוש סיבובי בורג נוספים של 180 מעלות. בדוק עם מלקחיים את יציבות הבורג והוסף סיבוב אחד נוסף אם לא מספיק חזק.
   הערה: עבור חולדות בוגרות, זה יבטיח מיקום אפידורלי של הברגים מבלי לפגוע בדורה או במוח (בהתאם לעיצוב הברגה של הבורג, מספר הסיבוב עשוי להשתנות). השימוש בברגי נירוסטה צריך להיות אפשרי גם מכיוון שגם בצפיפות זרם DCS מעל סף הניוון העצבי; מיקום הבורג לא הפריע למיקום הנגע או להיקף מתחת לברגים.
9. הפעל את המגהץ וחמם מראש למשך כ-5 דקות. סובב את הכבל היוצא ממנהרת הרקמות באופן עורפי סביב הבורג הקודקודי הימני ולאחר מכן חתוך אותו, והשאיר כבל של כ-1 ס"מ מאחורי הפיתול. הפשיטו בזהירות את הבידוד בקצה הכבל בעזרת אזמל.
10. תקן את הכבל המפותל לבורג ולעצם בעזרת דבק ציאנואקרילי.
11. מרחו כמות קטנה של הלחמת הפח נטולת העופרת על המחבר ועל החוטים החשופים של כבל האלקטרודה הנגדית וחברו את שניהם על ידי לחיצה קצרה על שני החלקים המולחמים מראש יחד תוך נגיעה בקצה ההלחמה עד שהלחמת הפח נמסה (כ-2-3 שניות). הסר את קצה ההלחמה מיד כדי למנוע חימום מתכת מוגזם של הכבל עם נזק לרקמות שלאחר מכן.
12. הרם את שקע האלקטרודה tES בהתאמה אישית (איור 1B, באדום) עם מלקחיים כפופים ומשוננים ומרח שכבה דקה של דבק ציאנואקרילי על השפה התחתונה של השקע. למיקום מעל קליפת המוח המוטורית ובאמצעות שקע בקוטר 4 מ"מ, מקם את נקודת השקע האמצעית ב-2 מ"מ קדמית ו-2 מ"מ לרוחב מהברגמה. עבור מיקום זה, הגבול המדיאלי הפנימי של השקע צריך להסתיים ישירות בתפר הסגיטלי, וגבול הזנב צריך להסתיים בגובה הברגמה. לחץ לחיצה קצרה על השקע על העצם (רוב הדבקים הציאנואקריליים מתקשים בלחץ).
    הערה: הצבת מקור אור ישירות מעל השקע יכולה להקל על מיקום השקע.
13. ודא שהעצם באזור השקע נקייה מדבק (על ידי בדיקה באור מכיוון שהדבק מחזיר אור). במקרה של שפיכת דבק, הסר את השקע, גרד את הדבק בעזרת האזמל וחזור על שלב 2.12.
14. לאחר שהשקע נמצא במקומו ואזור הגירוי העתידי נקי מדבק, אטום תחילה את הגבול הצדדי של השקע לרקמה השכנה עם טיפה קטנה של דבק ציאנואקרילי כדי למנוע גשר נוזלי שעלול להוביל לעיתוק זרם במיקום זה. אל תמרחו יותר מדי דבק מכיוון שהוא עלול לזרום לאזור הגירוי (אם זה קורה, חזרו לשלב 2.12).
    הערה: שמירה על אזור הגירוי נקי מדבק היא חיונית מכיוון שהפחתת אזור הגירוי עשויה להגדיל באופן דרמטי את צפיפות הזרם (A/m²).
15. מכסים את כל הברגים בדבק ציאנואקרילי.
16. מערבבים את המלט האקרילי הדנטלי הדו-רכיבי בצינור סיליקון קטן או בכוס. ברגע שהוא הופך לצמיג, יש למרוח אותו בעזרת מרית שיניים כדי לאטום את גבולות השקע הנותרים לעצם. הימנע מכל זרימה של מלט אקרילי דנטלי לאזור הגירוי.
17. לבסוף, כסו את כל הגולגולת, הברגים, כבל האלקטרודה הנגדית והשקע עד 1/3 מהשקע במלט אקרילי דנטלי. ודא שלמלט יש את הצמיגות הנכונה: אם הוא נוזלי מדי, הוא יזרום לרקמה שמסביב; אם זה קשה מדי, קשה להפיץ אותו באופן שווה.
18. כאשר כל העצם מכוסה והמלט מתקשה, הסר את מהדקי הבולדוג; העור צריך פשוט לגעת במלט המצטבר כך שלא יהיה צורך בתפירה. (אם החיתוך הראשוני נבחר ארוך מדי ורקמת החיבור או השריר נראים לעין, יש למרוח תפר כמתואר בשלב 1.12).
19. מרחו שכבה אחת של יוד עם צמר גפן סביב גבול העור החתוך והזריקו קרפרופן תת עורי (5 מ"ג/ק"ג משקל גוף מומס ב-5-7.5 מ"ל של 0.9% מי מלח לטיפול בכאב והחלפת נוזלים).
    הערה: אם משתמשים בהרדמה באינהלציה, כבו אותה כעת.
20. הנח את המכרסם בקופסת חימום להתאוששות מההרדמה עד שהמכרסם מתעורר ויציבות היציבה משוחזרת.
    הערה: בדוק את התפתחות המשקל של בעל החיים, מצב הפצע וקריטריוני הרווחה הכללית מדי יום בהתאם להמלצת המוסד.

3. הליך גירוי חשמלי טרנס-גולגולתי

הערה: מכיוון שההרדמה משפיעה על השפעות tES, מומלץ לבצע את הגירוי במכרסמים ערניים במידת האפשר. אפשר למכרסם להתאושש לפחות 5 ימים (ריפוי פצע הראש והחזה) לפני תחילת הניסויים. ניתן לבצע ניסויים בנקודות זמן מוקדמות יותר לאחר הניתוח בעת שימוש באלקטרודה נגדית חיצונית קבועה עם אפוד, מכיוון שהפצע בחזה הוא הרגיז ביותר, אך בעלי חיים צריכים להיות מורגלים לאפוד האלקטרודה למשך מספר ימים, ועלולה להתרחש הפרעה למשימות התנהגותיות.

1. מלאו את חצי שקע האלקטרודה tES במי מלח של 0.9% והסירו בועות אוויר.
2. לפני מפגשי גירוי זרם ישר טרנס-גולגולתי קתודלי (tDCS), בדוק תמיד כלור, ובמידת הצורך (כגון משטח כסף מבריק), כלור מחדש את האלקטרודה Ag/AgCl. לפני מפגשי tDCS אנודליים, הסר משקעי AgCl עודפים אפשריים מגירויים קודמים עם נייר זכוכית כדי לאפשר מוליכות טובה במהלך הגירוי. הברג את מכסה בורג האלקטרודה tES (איור 1B, חתיכה אפורה).
   זהירות: אי כלור מחדש של האלקטרודה בין מפגשי tDCS קתודליים יוביל למיצוי הכלור במהלך הגירוי ולהצטברות רעלים על ידי תגובה אלקטרוכימית. זה יגרום נזק לרקמות. אין צורך בהכלרה מחדש תוך מפגש אחד אם משך הגירוי קצר מ-20 דקות.
3. חבר את הכבלים לשני המחברים על הראש (לגירוי אנודלי, כבל האנודה מחובר למחבר שעל מכסה הבורג, לגירוי קתודה, זה ההפך).
   הערה: בעת שימוש באלקטרודת נגד הממוקמת חיצונית, כסה את האלקטרודה הנגדית בג'ל מוליך והנח אותה על חזה המכרסם. זה הכי קל אם האלקטרודה קבועה מראש באפוד מכרסם קטן, שהמכרסם יכול ללבוש במהלך הגירוי.
4. הכניסו את המכרסם לכלוב הניסוי, כשהכבלים מחוברים לסיבוב מעל הכלוב המאפשר תנועה חופשית.
5. הפעל את הסטימולטור והתאם את פרמטרי הגירוי (עוצמת הגירוי, משך הזמן, זמן עלייה וירידה).
6. כאשר אינך משתמש במכשיר גירוי זמין מסחרית עם אזעקת כיבוי וניתוק בטיחותית, כלול מד במעגל כדי לבדוק את זרימת הזרם הקבוע.
   הערה: עם הגדרה זו, ניתן ליישם גירוי במהלך ביצוע או אימון של משימות התנהגותיות.
7. בדוק אם יש סימני לחץ או אי נוחות במכרסם במהלך הגירוי.
8. לאחר סיום הגירוי, נתק את הכבלים, פתח את מכסה האלקטרודה על הראש ונקה וייבש את השקע בעזרת צמר גפן. החזירו את המכרסם לסביבה הביתית או המשיכו בהליך התנהגותי אם תרצו.

איור 1: אספקה לניתוח ותוכנית טכנית של שקע tES ויחידת מכסה האלקטרודה. (א) 1. צמר גפן, 2. חומר חיטוי, 3. מסגרת סטריאוטקטית, 4. מלחם, 5. משכך כאבים (למשל, קרפרופן), 6. ו-7. חומרי הרדמה (למשל, קסילזין וקטמין), 8. מזרק, 9. קליפר, 10. מנקב אוזניים, 11. משחת עיניים (למשל, בפנטן), 12. הלחמת פח נטולת עופרת, 13. צמנט אקרילי דנטלי דו-רכיבי (DAC), 14. יוד, 15. 3% H2O2, 16. 0.9% מי מלח, 17. תפר קלוע סינטטי שאינו נספג (למשל, מרסילן 4-0), 18. מקדחים, 19. דבק ציאנואקרילי, 20. מהדקי בולדוג 21. מלקחיים הומאוסטטיים, 22. מלקחיים כפופים ומשוננים, 23. מלקחיים ישרים וחדים, 24. ישר, מלקחיים לרקמות, 25. מרית שיניים, 26. אזמל, 27. מספריים, 28. מקדחה ידנית, 29. מברג, 30. מקדחה מונעת מנוע, 31. מחברים נקביים, 32. שקע tES, 33. אלקטרודת פלטינה מרובעת המחוברת לכבל, מפרק הלחמה מכוסה בדבק היסטואקרילי, 34. ברגי פלסטיק. (B) שקע tES (אדום) לקיבוע על גולגולת המכרסם בקוטר פנימי של 4 מ"מ; יחידת האלקטרודה (אפורה) בנויה על ידי מכסה בורג וחותמת פנימית עם חור מרכזי המשאיר מקום לכבל של אלקטרודת הדיסק Ag/Cl, המודבקת לתחתית החותמת. זה מאפשר יציבות מקסימלית של ההתקנה והימנעות משבירות חוטים בנקודת החיבור הרגישה של חוט-אלקטרודה.