הדמיה in vivo של תגובות נוירונים של גנגליון גניקולאט באמצעות מיקרוסקופיה אפיפלואורסצנטית

תקציר

מקור: Fowler, B. E., et al. הדמיית סידן in vivo של תגובות נוירונים גנגליון גנגליון של עכבר לגירוי טעם. J. Vis. Exp. (2021)

סרטון זה מדגים פרוטוקול להעברת טעמים לגנגליון הגניקולט שנחשף בניתוח בעכבר מורדם ושימוש בפלואורסצנטיות GCaMP עם מיקרוסקופיה אפיפלואורסצנטית כדי להמחיש תגובות עצביות בזמן אמת, ומסייע למחקרים על עיבוד אותות טעם היקפי.

פרוטוקול

כל ההליכים הכוללים מודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ומועצת הביקורת הווטרינרית של JoVE.

1. הפעל את לוח tastant
   1. השתמש ביניקה כדי להסיר נוזל מעל הגניקולט. לחלופין, מקם נקודת ספיגה כדי לסייע בהפחתת החלחול ולסייע בניווט במיקרוסקופ.
   2. הניחו את החיה על כרית סופגת מתחת למיקרוסקופ. אתר את הגנגליון הגניקולטי: ציוני דרך שימושיים כוללים את החור שנותר בבולה, החור בעצם הטמפורלית והעצב השביעי. באמצעות מסנן FITC/GFP (Fluorescein Isothiocyanate/חלבון פלואורסצנטי ירוק) בהיקף האפיפלואורסצנטי, בדוק אם יש נוירונים בודדים של גנגליון גנגליון גנקולטי המבטאים GCaMP. מטרה של פי 10 (מרחק עבודה של 10 מ"מ) תספק רזולוציה מספקת כדי לעקוב אחר הפעילות של תאים בודדים, אך ניתן להשתמש גם במטרה של פי 20 (מרחק עבודה של 12 מ"מ).
   3. הנח את מחט החלוקה לקו הטסטנט בחוזקה בפיו של בעל החיים. הניחו צלחת פטרי מתחת לפה של החיה כדי לתפוס נוזלים.
   4. ודא שהמצלמה צופה בשדה הראייה של המיקרוסקופ. סנכרן את תחילת הקלטת הווידיאו עם תחילת מצגת הטעם.
   5. במהלך ההקלטה, צפה בשידור החי לתגובות, סחיפה וחלחול.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
1ml מזרק עם מנעול luer	פישר סיינטיפיק	14-823-30
27 מד קהה מחט חלוקה	פישר סיינטיפיק	NC1372532
נקודות ספיגה	פישר סיינטיפיק	50-930-668
Acesulfame K	Fisher Scientific	A149025G
BD מגשי אלרגיסט עם מחט מחוברת לצמיתות	Fisher Scientific	14-829-6D
מחזירים קהים	FST	18200-09
Breadboard	Thor Labs	MB8
מותאם אישית מחזיק עמוד ראש	eMachineShop		ראה קובץ מצורף 202410.ems
מותאם אישית מתכת ראש פוסט	eMachineShop		ראה קובץ מצורף 202406.ems
בקר טמפרטורת DC	FHC	40-90-8D
מצלמה דיגיטלית, sCMOS OrcaFlash4 מיקרוסקופ רכוב	Hamamatsu	C13440
היקף חיתוך	Leica	M80
LED מקור אור קר	Leica Mcrosystems	KL300LED
Luer Lock 1/16 "מתאמי צינורות	פישר	01-000-116
מיקרוסקופ	אולימפוס	BX51WI
מיני סדרה פוסטים אופטיים	Thorlabs	MS2R
צלחות פטרי	פישר	FB0875713A
אוויר בלחץ	Airgas	AI Z300
תיוג הדבקה עצמית קלטת	פישר סיינטיפיק	159015R
צינורות שסתום צביטה סיליקון 1/32 אינץ' x 1/16 אינץ' OD (לכל רגל)	אוטומציה מדעית	05-14
Snap25-2A-GCaMP6s-D	JAX	25111
מספריים עדינים לסטודנטים	כלי מדע עדינים	91460-11
בדיקה כירורגית	Roboz חנות כירורגית	RS-6067
מחזיק בדיקה כירורגית	Roboz חנות כירורגית	RS-6061
BD צינורות תוך-רפואיים	פישר סיינטיפיק	22-046941
רגולטור גז דו-שלבי	Airgas	Y12FM244B580-AG
Tygon צינורות ויניל - 1/16 אינץ'	Automate Scientific	05-11
Valvelink8.2 בקר דיגיטלי/ידני	אוטומציה Scientific	01-18
Valvelink8.2 מערכת זלוף שסתום צביטה	אוטומציה מדעית	17-pp-54
קסילזין	Anased	NADA# 139-236