ניתוח מורפולוגיה דנדריטית על פני שכבות ועמודים של מדולה דרוזופילה

תקציר

מקור: Ting, C., et al., ניתוח מורפולוגיה דנדריטית בעמודות ושכבות. J. Vis. Exp. (2017)

סרטון זה מדגים את ההליך של הכנת מוח דרוזופילה, לכידת ערימות תמונות אופקיות וקדמיות של דנדריטים מדולה עם תווית GFP תחת מיקרוסקופ קונפוקלי, ויצירת שחזור תלת מימדי לניתוח המורפולוגיה שלהם על פני שכבות ועמודות.

פרוטוקול

1. רכישת תמונה כפולה

הערה: שלב זה נועד לרכוש שתי ערימות תמונות של הנוירון המעניין בשני כיוונים אורתוגונליים (אופקיים וחזיתיים).

1. הכן מוחות זבובים המכילים נוירוני מדולה מתויגים בדלילות (~10 תאים/אונת מוח) עם סמן חלבון פלואורסצנטי ירוק ממברנה (GFP) (mCD8GFP). לצבוע את המוח באנטי-GFP של ארנב (עבור דנדריטים של נוירונים מדולה) ו-mAb24B10 של עכבר (עבור אקסונים קולטני אור), נוגדנים ראשוניים ונוגדנים משניים פלואורסצנטיים (נוגדנים נגד ארנב Alexa 488 ו-Alexa 568 נגד עכברים). נקה את המוח ב-70% גליצרול בתמיסת מלח 1x עם חוצץ פוספט (PBS).
2. כדי להרכיב את המוח בכיוון האופקי (איורים 1A, B), העבירו את מוח הזבוב המנוקה מגליצרול לטיפה של 20 מיקרוליטר של מדיום הרכבה מונע דהייה במרכז השקופית.
3. חבר טלאים קטנים של חימר ב-4 פינות הכיסוי כדי למנוע מהכיסוי לרסק את דגימת המוח במהלך ההרכבה.
   הערה: טלאי החימר מספקים ריפוד כדי למנוע מהכיסוי לרסק את הדגימה. כל כתם חרס צריך להיות בקוטר של כ -1 מ"מ.
4. תחת מיקרוסקופ מנתח, מקם את המוחות במצב הגחון למעלה והנח את הכיסוי למעלה כדי לאבטח את המוח. השתמשו במשטח הגבי הקמור של המוח כנקודת ציון כדי לזהות את הכיוון של דגימת המוח (איור 1A).
5. השג את ערימת התמונות הראשונה (תצוגה אופקית) עם מיקרוסקופ קונפוקלי. השתמש בעדשת אובייקט עם NA גבוה (כגון גליצרול 63X 1.3 N.A. או עדשת אובייקט טבילה בשמן) וזום דיגיטלי 2.5X (גודל הפיקסלים הוא 0.105 מיקרומטר לפיקסל; המספר הממוצע הוא 2). רכוש יותר מ-180 חלקים אופטיים (512 x 512 פיקסלים) כדי לכסות את המדולה נוירופיל בגודל צעד של 0.2 מיקרומטר.
6. הרכיבו מחדש את המוח, אך יישרו את המוח במצב הקדמי כלפי מעלה (מבט חזיתי).
7. רכשו את ערימת התמונות השנייה (מבט חזיתי) של אותו תא עצב.
   הערה: מציאת אותו תא עצב עשויה להיות מאתגרת כאשר ישנם תאי עצב רבים המסומנים באונה האופטית. כדי לזהות את אותם נוירונים משני הכיוונים, ייתכן שיידרשו ערימות תמונות בהגדלה נמוכה יותר משתי התצוגות (לדוגמה, השתמש בזום של 0.7 ובגודל צעד של 0.45 מיקרומטר כדי לרכוש ערימות תמונות ברזולוציה נמוכה). אם התמונה גדולה מ- 512 x 512, יש לחתוך את התמונה ל- 512 x 512 לפני שילוב התמונה, ולשמור על גודל פיקסלים של 0.105 מיקרומטר לפיקסל בשעת הדמיית השדה הגדול. אובדן אות הוא בעיה פוטנציאלית לרקמות עמוקות. אם האות חלש, דמו את החצי הגחוני של המוח. כדי להפחית את ההלבנה במהלך הסריקה, השתמש בעוצמת לייזר נמוכה ככל האפשר. השתמשו במחוון הטווח כדי לבדוק אם יש חשיפת יתר לפני רכישת אוספי תמונות. במידת האפשר, השתמש במיקרוסקופ קונפוקלי המצויד בגלאי GaAsP.
8. זהה ורשום את מיקום הנוירון המעניין ביחס לנוירופיל המדולה (ימין/שמאל [R/L] וגבי/גחון [D/V]). בדוק אם הדגימה זזה במהלך רכישת התמונה על ידי בחינת ערימת התמונות.
   הערה: הזזת הדגימה נובעת לרוב מהרכבה לא נכונה. אם מתרחשת תנועה לדוגמה, לא ניתן להשתמש באוסף התמונות לרישום ויש להשליכו. הרכיב מחדש את הדגימה ורכוש ערימות תמונות מאותו נוירון.

2. דה-קונבולוציה של תמונה

הערה: שלב הפירוק משתמש בתוכנת דה-קונבולוציה של תמונה כדי לשחזר את התמונות שנרכשו שנפגעו על ידי טשטוש ורעש. למרות ששלב זה הוא אופציונלי, הוא משפר משמעותית את איכות התמונה.

1. הפעל את תוכנית הדה-קונבולוציה במצב אינטראקטיבי. טען את ערימת התמונות (בתבנית lsm או בתבנית מיקרוסקופית ספציפית) על-ידי בחירה באפשרות Menu: File/Open (או Ctrl-o) בחלון הראשי.
2. לחצו לבחירת אוסף התמונות שנטען ובחרו 'תפריט: אופס' לפתיחת חלון פעולת התמונה. השתמש באלגוריתם ברירת המחדל של הערכת סבירות מרבית קלאסית (CMLE).
3. בחלון פעולת התמונה, לחץ על הכרטיסייה "פרמטרים". הזן את הפרמטרים המתאימים למדיום הטבילה של העדשה (למשל, שמן, גליצרין וכו'), מדיום הטמעה (למשל, שמן טבילה וכו') וצמצם מספרי (NA; כאן נעשה שימוש ב-1.3). בדוק את הפרמטרים הנותרים כדי לוודא שהם משקפים נכון את תנאי ההדמיה. לחץ על הכרטיסייה "הגדר הכל מאומת" כדי לסיים את הגדרות הפרמטר.
4. בחלון פעולת התמונה, לחץ על הכרטיסייה "פעולה". הקצה יעד פלט (למשל, ג). הזן את המספרים המתאימים ב"אות/רעש לכל ערוץ" (למשל, "12 12 12 12" היא נקודת התחלה טובה, בעוד שהגדרת ברירת המחדל היא "20 20 20 20"). השתמש בהגדרות ברירת המחדל עבור הפרמטרים הנותרים.
5. לחץ על הכרטיסייה "הפעל פקודה" כדי להתחיל לפרק את ערימת התמונות; בהתאם למחשב, תהליך זה עשוי להימשך עד עשרות דקות.
6. בחלון הראשי, לחצו ובחרו באוסף התמונות המפותל. בחר Menu: Save As כדי לשמור את התמונה המפותלת בתבנית קובץ התמונה ICS (.ics ו- .ids).
   הערה: כל אוסף תמונות כולל שני קבצים: קובץ ics מכיל את הכותרת informatio,n וקובץ ה-ids מכיל את נתוני התמונה הגולמיים.
   1. שנה את שמות קובצי אוסף התמונות בהתאם לכיוון ההדמיה (לדוגמה, תן לאוספי התמונות בתצוגה אופקית את השם H.ids ו-H.ics ולאוסף התמונות בתצוגה הקדמית F.ids ו-F.ics).

3. שילוב תמונות כפול

הערה: שלב זה משלב שתי ערימות תמונות ליצירת תמונות תלת מימד ברזולוציה גבוהה באמצעות תוכנת MIPAV.

1. יצירת מטריצות לשילוב תמונות.
   1. התחל את תוכנית MIPAV. טען את אוספי התמונות H ו-F על-ידי בחירה באפשרות Menu: File/Open image (A) from Disk (או Ctrl-f) /H.ids ו-F.ids; החלון יציג שתי תמונות.
   2. לחץ על התמונה H ובחר Menu: Utilities/Conversion Tools/RGB/Grays; החלון יציג תמונות GrayG, GrayB ו-GrayR.
   3. סגור את GrayR ו-GrayB, והשאר רק את GrayG בחלון.
   4. לחץ על התמונה F ובחר Menu: Utilities/Conversion Tools/RGB/Grays. החלון יציג תמונות GrayG1, GrayB1 ו-GrayR1.
   5. סגור את GrayR1 ו-GrayB1 והשאר רק את GrayG1 על החלון. בשלב זה, רק GrayG ו-GrayG1 נמצאים על החלון.
   6. בחר את GrayG (הדגשה) ובחר Menu: Algorithms/Registration/Optimized Automatic Image Registration; תיבת הדו-שיח "Optimized Automatic Image Registration 3D" תופיע.
      1. באפשרויות הקלט, שנה את "דרגות החופש" מברירת המחדל "Affine-12" ל-"Specific rescale-9". ב"סיבובים", הזן -105 עד 105 ב"טווח דגימת זווית סיבוב" (ברירת מחדל: -30 עד 30 מעלות), 10 ב"מרווח זווית גסה" (ברירת מחדל: 15 מעלות), ו-3 ב"תוספת זווית עדינה" (ברירת מחדל: 6 מעלות).
   7. לחץ על OK. המטריצה הראשונה, "GrayG_To_GrayG1.mtx", תיווצר ותישמר בתיקיית התמונה. סגור את כל חלונות התמונה והמשך לשלב הבא, שייקח לפחות 15 דקות.
   8. טען את אוספי התמונות H ו-F על-ידי בחירה באפשרות Menu: File/Open image (A) from Disk (או Ctrl-f) /H.ids ו-F.ids.
   9. בחר את תמונת H על ידי לחיצה על התמונה ובחר תפריט: כלי עזר/כלי המרה/RGB/אפור; תיבת הדו-שיח "RGB->אפור" תופיע. לחץ על OK; החלון יציג תמונות "HGray". שמור על HGray וסגור את תמונת H.
   10. חזור על שלב 3.1.9 עבור תמונת F; תמונות "FGray" יופיעו בחלון. שמור על FGray וסגור את תמונת F; רק HGray ו-FGray יישארו על החלון.
   11. בחר את תמונת HGray (הדגשה) ועבור לתפריט: אלגוריתמים/כלי טרנספורמציה/טרנספורמציה. תיבת הדו-שיח "טרנספורמציה/דגימה מחדש של תמונה" תופיע. לחץ על הכרטיסייה "דגימה מחדש" ושנה את הדגימה מחדש לגודל של "HGray" ל-"FGray". לאחר מכן, לחץ על הכרטיסייה "המרה" וטען את "GrayG_To_GrayG1.mtx" על ידי בחירת "קרא מטריצה מקובץ". לחץ על OK; החלון יציג את התמונה HGray_transform. סגור את תמונת HGray כך שרק HGray_transform ו-FGray יישארו על החלון.
   12. בחר את התמונה "HGray_transform" (הדגשה) ועבור לתפריט: אלגוריתמים/רישום/רישום תמונה אוטומטי אופטימלי. תיבת הדו-שיח "אופטימיזציה אוטומטית לרישום תמונה תלת-ממדי" תופיע. ב"סיבובים", הזן -5 עד 5 ב"טווח דגימת זווית סיבוב" (ברירת מחדל: -30 עד 30 מעלות), 3 ב"תוספת זווית גסה" (ברירת מחדל: 15 מעלות), ו-1 ב"תוספת זווית עדינה" (ברירת מחדל: 6 מעלות). לחץ על OK.
       הערה: מטריצת Affine (HGray_transform_To_FGray.mtx) תיווצר ותישמר בתיקיית התמונה, והתמונה "HGray_Transform_register" תוצג בחלון. שלב זה ייקח לפחות 40 דקות.
   13. סגור את התמונה "HGray_transform"; יש להשאיר רק את האותיות "HGray_Transform_register" ו- "FGray" על החלון.
   14. בחר בתמונה "HGray_Transform_register" (הדגשה) ועבור לתפריט: אלגוריתמים/רישום/רישום אוטומטי B-Spline 2D/3D. תיבת הדו-שיח "B-Spline Automatic Registration-3D intensity" תופיע. בחר "ריבועים פחותים" בפונקציה עלות (ברירת המחדל היא יחס מתאם).
       1. לחץ על "בצע רישום שני מעברים". במקטע Pass 1, הקלד 2 ב-"Gradient Descent Minimal Step Size (sample units)" (ברירת המחדל היא 1) והקלד 10 ב-"Maximum Number of Iterations:" (ברירת המחדל היא 10). בקטע Pass 2, הקלד 1 לתוך "Gradient Descent Minimal Step Size (יחידות לדוגמה)" (ברירת המחדל היא 0.5) והקלד 2 לתוך "מספר מקסימלי של איטרציות:" (ברירת המחדל היא 10).
          הערה: מטריצת ה-NLT, "HGray_transform_register.nlt", תישמר בתיקיית התמונה, והתמונה "HGray_transform_register_registered" תוצג בחלון. שלב זה ייקח לפחות 5 דקות.
   15. סגור את כל התמונות בחלון.
2. יצירת תמונת ההתייחסות לשילוב תמונה.
   הערה: שלב זה נועד ליצור תמונה אופקית רשומה לשילוב.
   1. טען אוספי תמונות H ו-F על-ידי בחירה באפשרות Menu: File/Open image (A) from Disk (או Ctrl-f) /H.ids ו-F.ids; שתי תמונות יופיעו בחלון.
   2. בחר את התמונה H (הדגשה) ועבור אל תפריט: אלגוריתמים/כלי טרנספורמציה/המרה; תיבת הדו-שיח "המרה/דגימה מחדש של תמונה" תופיע. לחץ על הכרטיסייה "דגימה מחדש" ושנה את הדגימה מחדש מגודל של "H" ל-"F". לאחר מכן, לחץ על הכרטיסייה "המרה" וטען את "GrayG_To_GrayG1.mtx" על ידי בחירה באפשרות "קרא מטריצה מקובץ". לחץ על OK; התמונה H_transform תופיע על החלון. סגור את תמונת H אך השאר את H_transform ו- F בחלון.
   3. בחר את התמונה "H_transform" (הדגשה) ועבור אל תפריט: אלגוריתמים/כלי טרנספורמציה/טרנספורמציה; תיבת הדו-שיח "המרה/דגימה מחדש של תמונה" תופיע. לחץ על הכרטיסייה "דגימה מחדש" ושנה את הדגימה מחדש מגודל של "H_transform" ל-"F". לאחר מכן, לחץ על הכרטיסייה "המרה" וטען את "HGray_transform_To_FGray.mtx" על ידי בחירה באפשרות "קרא מטריצה מקובץ". לחץ על OK; התמונה "H_transform_transform" תופיע על החלון. סגור את התמונה H_transform; בשלב זה, רק H_transform_transform ו-F יישארו על החלון.
   4. בחר בתמונה "H_transform_transform" (הדגשה) ועבור לתפריט: אלגוריתמים/כלי טרנספורמציה/טרנספורמציה לא ליניארית; תיבת הדו-שיח "טרנספורמציה לא ליניארית של B-Spline" תופיע. לאחר מכן, טען את "HGray_transform_register.nlt" ולחץ על אישור; התמונה "H_transform_transform_registered" תופיע על החלון. שמור את התמונה כקובץ ics. סגור את כל התמונות בחלון.
3. שילוב אוספי תמונות
   הערה: שלב זה משלב שתי ערימות תמונות שנרכשו בכיוונים אורתוגונליים (אופקי וחזיתי) לערימה אחת ברזולוציה גבוהה.
   1. עבור לתפריט: Plugins/Generic/Drosophila Retinal Registrationl; תיבת הדו-שיח "רישום רשתית של דרוזופילה v2.9" תופיע. העלה את "H.ics" בתמונה H, "H_transform_transform_registered" משלב 3.2.4 בתמונה H-רשומה, "F.ics" בתמונה F, "GrayG_To_GrayG1.mtx" משלב 3.1.7 בטרנספורמציה 1-ירוק (אופציונלי), "HGray_transform_To_FGray.mtx" משלב 3.1.12 בטרנספורמציה 2-Affine ו-"HGray_transform_register.nlt" משלב 3.1.14 בטרנספורמציה 3-לא ליניארית (אופציונלי).
      1. בחר SqRT (עוצמה-H x עוצמה-F) וללא שינוי קנה מידה ב"שינוי קנה מידה מ-H ל-F". שמור את אפשרויות ברירת המחדל עבור הפרמטרים הנותרים. לחץ על OK; שלב זה יימשך כ-3 דקות.
         הערה: לאחר העיבוד, ייווצרו 3 קבוצות של תמונות: combinedImage_sqrRt_trilinear_norescale_ignoreBG.ids (התמונה המשולבת הסופית), greenChannelsImage-Gxreg-Gy-Gcomp.IDS (ערוץ ירוק עבור H, F והתמונה המשולבת הסופית), ו-redChannelsImage-Rxreg-Ry-Rcomp.ids (ערוץ אדום עבור H, F והתמונה המשולבת הסופית); כל קבצי הפלט ישתנו ל-512 x 512 x 512
   .
   2. פתח את "combinedImage_sqrRt_trilinear_norescale_ignoreBG.ids" תחת תוכנת הדמיית התמונות. שמור את אוסף התמונות בתבנית ims ושנה את שם הקובץ. קובץ תמונה משולב זה ישמש למעקב ורישום נויריט.

4. מעקב אחר נויריטים והקצאת נקודת ייחוס

הערה: שלב זה כולל מעקב אחר נויריטים (4.1) והקצאת נקודות ייחוס לרישום (4.2) באמצעות תוכנת הדמיית התמונה.

1. מעקב אחר נויריטים
   1. הפעל את תוכנת הדמיית התמונה. פתחו את קובץ התמונה המשולב מחדש. עבור לתפריט: ערוך/הצג התאמת תצוגה וכבה את ערוץ קולטני האור (אדום).
   2. דמיין את התמונה במצב "התעלה על". אם המחשב מצויד במערכת סטריאוגרף, הפעל את "סטריאו" והשתמש במצב "Quad Buffer" כדי לדמיין תמונות תלת מימד.
   3. עבור לתפריט: עודף/חוטים כדי להוסיף חוטים חדשים. לחץ על הכרטיסייה "דלג על יצירה אוטומטית, ערוך ידנית".
   4. לחץ על הכרטיסייה "צייר" ובחר "עומק אוטומטי".
   5. בחר "הגדרות", סמן "קו" והקליד מספר פיקסלים מתאים להדמיה טובה יותר (קו של 4 פיקסלים משמש בפרוטוקול זה). סמן "הצג דנדריטים", "נקודת התחלה" ו"נקודות הסתעפות". הגדר את "איכות העיבוד" ל-100%.
   6. בחר בכרטיסייה "צייר" והתחל לעקוב אחר נויריטים. התחילו עם האקסון ואז עברו לדנדריטים (איור 1D). קל להבדיל בין האקסון והדנדריטים של נוירונים טרנסמדולה.
      הערה: נוירון Tm מרחיב את האקסון שלו מגוף התא ומקרין כל הדרך למרכז העיבוד החזותי הגבוה יותר, הלובולה. המערכת תגדיר אוטומטית את החוט הארוך הראשון כאקסון ואת החוטים הקצרים הנותרים כדנדריטים. שמרו על נקודת ההתחלה בתחילת החוט (אקסון) במהלך המעקב, וודאו שהנויריטים העקבות מחוברים. בחן את נקודות ההסתעפות ואת נקודת ההתחלה. אם הדנדריטים אינם מחוברים, תוגדר נקודת התחלה חדשה בחוט הלא מחובר.
   7. לאחר המעקב, חזור ל"הגדרות", בטל את הסימון של "נקודת התחלה" ו"נקודת הסתעפות", ועבור לתפריט: התעלה/ייצוא אובייקטים נבחרים. /. שמור את החוט כקובץ ממציא (*.iv).

תוצאות

איור 1. הכנת דגימה להדמיה כפולה והסימטריה של מערך העמודים של Drosophila Medulla. (A, B) הרכבה לדוגמא להדמיה כפולה. (A) המראה מוצג כאילו הוא מסתכל על המוח דרך כיסוי. (ב) דיאגרמות סכמטיות להרכבת מדגם. ...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
Software
Huygens Professional	Scientific Volume Imaging	גרסה 16.05	לפירוק תמונה (https://svi.nl). תוכנה מסחרית
MIPAV		גרסה 7.3.0	עבור קומבינציה ורישום של תמונות (http://mipav.cit.nih.gov/.).
תוכנה חופשית תוסף MIPAV: PlugInDrosophilaRetinalRegistration.class			תוכנה חינמית
תוסף MIPAV: PlugInDrosophilaStandardColumnRegistration.class			תוכנה חופשית
Imaris	Bitplane		למעקב אחר נויריטים והקצאת נקודות ייחוס לרישום תמונה (http://www.bitplane.com). תוכנה מסחרית
Vaa3D			להמחשת קבצי SWC (https://github.com/Vaa3D/release/releases/). תוכנה חינמית
Matlab	Mathworks	R2014b	לניתוח מורפומטרי של דנדריטים (http://www.mathworks.com). תוכנה מסחרית
ארגז הכלים Matlab: TREES1.14		v1.14	לניתוח פרמטרים מורפומטריים דנדריטיים ( http://www.treestoolbox.org/download.html). תוכנה חינמית
ארגז הכלים Matlab: Dendritic_Tree_Toolbox		v1.0	לחישוב פרמטרים מורפומטריים (https://science.nichd.nih.gov/confluence/display/snc/Data+collections+for+imagines+combination+and+standardize+column+registration). תוכנה חופשית
קבצים
הגדרת			קובץ SWC http://www.neuronland.org/NLMorphologyConverter/MorphologyFormats/SWC/Spec.html
הקודים והקבצים לדוגמה לשילוב ורישום תמונות			https://science.nichd.nih.gov/confluence/display/snc/Data+collections+for+imagines+combination+and+standardize+column+registration
דוגמה			לנקודת התייחסותhttps://science.nichd.nih.gov/confluence/download/attachments/117216914/points.csv?version=1&modificationDate=1471880596000&api=v2
מערכת
MS Windows Windows 7 x64 או Macintosh OS X 10.7 ואילך			מעבד 3GHz 64 סיביות מרובע ליבות, 16G RAM (מינימלי)
אופציונלי: כרטיס גרפי Quadro4000 (ומעלה)	Nvidia		להדמיה סטריאוגרפית של דנדריטים.
אופציונלי: NVIDIA 3D vision2	Nvidia		http://www.nvidia.com/object/3d-vision-main.html
אופציונלי: צג LCD של 120 הרץ עבור NVIDIA 3D vision2			http://www.nvidia.com/object/3d-vision-system-requirements.html
ריאגנטים להדמיה
24B10 נוגדן	המחקרים ההתפתחותיים בנק היברידומה	24B10
GFP תג נוגדן	Thermofisher Scientific	G10362
עיזים נגד ארנב (H+L), Alexa Fluor 488	Thermofisher Scientific	A11034
עיזים נגד עכבר (H+L), Alexa Fluor 568	Thermofisher Scientific	A21124
VECTASHIELD Antifade הרכבה	מעבדות וקטור	H-1000
הרכבה קליי	פישר	S04179
70% גליצרול ב-1X PBS
משקפי כיסוי, ביצועים גבוהים, D=0.17 מ"מ	Zeiss	474030-9000-000

לדוגמה מחשב בינוני