מאמר שיטה

Enucleation עיני העכבר לphenotyping מרחוק תפוקה גבוהה

DOI:

10.3791/3184

⸱

19 בנובמבר 2011

 ,  ,  ,  , 
1Department of Ophthalmology and Visual Sciences, University of Iowa, 2Omics Laboratory, University of Iowa, 3School of Dentistry, UCLA, 4Bernard and Shirlee Brown Glaucoma Laboratory, Department of Ophthalmology, College of Physicians and Surgeons, Columbia University

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

טכניקת הנתיחה ממחישה enucleation של עין העכבר לקיבוע רקמות כדי לבצע phenotyping במסכי תפוקה גבוהה.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עין העכבר היא מודל גנטי חשוב למחקר translational של מחלת עיניים אנושית. מחלות מסנוורות בבני אדם, כגון ניוון מקולרים, ניוון photoreceptor, קטרקט, גלאוקומה, רטינובלסטומה, רטינופתיה סוכרתית וכבר סכם בעכברים מהונדסים. 1-5 עכברים הטרנסגניים ונוקאאוט רוב נוצרו על ידי מעבדות ללמוד מחלות שאינן לרפואת עיניים, אבל שימור גנטי בין מערכות איברים עולה כי רב מאותם הגנים עלולים גם לשחק תפקיד בהתפתחות מחלה ועינית. לפיכך, העכברים האלה מייצגים משאב חשוב לגילוי מתאמים חדשים גנוטיפ-פנוטיפ בעיניים. כי עכברים אלו מפוזרים על פני הגלובוס, קשה לרכוש, לתחזק ופנוטיפ בצורה יעילה וחסכונית. לפיכך, מסכי phenotyping רפואת עיני תפוקה הגבוהה ביותר מוגבלים לכמה מקומות שדורשים באתר, מומחיות העינים לבחון את העיניים בעכברים חיים. 6-9 גישה חלופית שפותחה על ידי המעבדה שלנו היא שיטה לרקמות רכישה מרחוק שניתן להשתמש בו בסקרים גדולים או בקנה מידה הקטן של עיני עכבר מהונדסות. נהלים סטנדרטיים להעברת וידאו מבוסס כירורגית מיומנות, קיבעון רקמות, ומשלוח לאפשר לכל מעבדה כדי לאסוף עיניים שלמות מבעלי חיים מוטנטים ולשלוח אותם לphenotyping מולקולרי ומורפולוגי. במאמר זה וידאו, אנו מציגים טכניקות לenucleate ולהעביר עיני עכבר קבועות גם מבולבלות וזלוף לניתוחי phenotyping מרוחקים.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Dissection הבוטה: enucleation של עין העכבר בדגימות מבולבלות

  1. לפרק את העפעפיים כדי לשפר את החשיפה וגישה למשטח הגלובוס האחורי (גלגל עין).
  2. הנח מלקחי הלבשה מעוקלים מאחור (תחת) את כדור הארץ במסלולו (שקע עין). Mahajan Sharptip הלבשת המלקחיים הם מכשיר מותאם אישית עם מחודדים כדי לעשות את הצעד הזה קל יותר (ראה טבלת חומרים וריאגנטים).
  3. סגור את המלקחיים ותופס את רקמת חיבור מסלולית ועצב אופטי מאחורי העולם בעת היותו זהיר ולהימנע מסחיטת הגלובוס.
  4. משוך בעדינות את המלקחיים כלפי מעלה וקוטף את גלגל העין ממסלולו. הרקמות הלבנות דמויות חוט היא עצב הראייה.
  5. הנח את העין בPBS. באמצעות מחט 30-מד, לבצע ניקור יחיד לפצוע מייד אחורי לימבוס ידי הוספת 1-2 מ"מ המחט לתוך גלגל העין. זה מאפשר fixatives, כגון glutaraldehyde, שאחרת לא הצליחו לחדור לרקמות העין, לישירות enter העין. יצירה של פצע זה לא יכול להיות הכרחית אם מקבע, כגון paraformaldehyde או אלכוהול, הוא מסוגל לשדר לרקמות עין של עניין.
  6. הנח כל העין באופן מיידי למקבע לקיבעון טבילה.

2. Dissection שארפ: enucleation של קיבעון זלוף בא עין העכבר

  1. השתמש Colibri מלקחיים מעוקלים, כדי להחזיק את העפעף מהעולם.
  2. מספריים מעוגלים אוריינט Westcott נתיחה מקביל לעולם, תוך חתירה לכיוון חלק האחורי של המסלול.
  3. חותך את רקמת חיבור הקבועה שמקיפה את הגלובוס מהצדדים הנחותים, המדיאלי, המעולים, ורוחב.
  4. הנח את המלקחיים המעוקלים מאחורי העולם, אחוז ברקמת החיבור, מבלי ללחוץ על הגלובוס, ולמשוך קדימה כדי enucleate העין. מאז רקמת חיבור מסלולית היא נוקשה מקיבעון זלוף, חיתוך נוסף של רקמות מסלול עשוי להיות נחוץ כדי לשחרר את הגוש לחלוטיןדואר.

3. קיבעון ואריזה

משלוח של רקמות קבועות חייב לעקוב אחר הדרישות המוסדיות ודואר שירותך כולל תוויות ואריזה מתאימות. הפרוטוקול הבא הוא דוגמה למשלוח דגימה ביולוגית שאינן מדבקת בטמפרטורת הסביבה. זה דורש 3 שכבות של אריזה אבל לא ברמת חומר ביולוגי / B או תוויות של חנקן נוזליות.

  1. הנח את העין לתוך בקבוקון זכוכית נצנץ 5-מ"ל עם לפחות מקבע 3-מ"ל, או הבולם לאחר מקבע אם הקיבעון הוא קצר. כתוב את מספר המעקב על מכסה מכל ולאטום אותו עם Parafilm.
  2. בקבוקוני scintillation מקום לדגימה ביולוגית שאושרו מכולה. במכון שלנו, למשל, מכולות שאושרו דורשות שלוש שכבות: מכל אטום שבמדגם ממוקם, שכבה אמצעית סופגת, ושכבה חיצונית ומגנה.
  3. הנח את המכל לתוך חבילת אריזות בועות ולאחר מכן ליישוםמכל שוטט מעבדת משלוח יחד עם תיעוד מתאים.

4. נציג תוצאות

בדיקה היסטולוגית של עיניים יכולה להתבצע על ידי מגוון שיטות, כולל Hematoxylin ומכתימים Eosin, זיהוי ביטוי האנזימטית מיקרוסקופ אלקטרוני הילוכים, ואימונוהיסטוכימיה. לאחר טבילה בקיבעון paraformaldehyde 4%, רקמה הייתה מוטבעת בפרפין ונותח על microtome. בphenotyping תפוקה גבוהה, אנו מנתחים את סעיפי עצב אופטי תלמיד שהמדגם כל סוגי הרקמות בעין (איור 1). קטעי הרקמה נבדקו גם לביטוי lacZ (איור 2), מיקרוסקופ אלקטרוני הילוכים של אברונים סלולריים (איור 3), וביטוי של מולקולות ספציפיות עם נוגדנים (איור 4).

בשיטת הקרנת הפנוטיפ שלנו, זה לא היה חשוב לשמור על נטייה של העין ביחס לאף (canthus מדיאלי) וזמן (lateraצדדים) l canthus. יש לפחות שתי אפשרויות אם נטיית עין היא הכרחית. לאחר enucleation, יש לנו להחיל כוויית אור לקרנית הזמנית במעמד 03:00 עם מכשיר כוויית כף יד. הנגע ברור על היסטולוגיה ואינו הולכות לאיבוד בעיבוד כמו דיו היסטולוגית. החסרון הוא כי ניזקי כווייה בקרנית, אשר עשוי להיות קריטיות לבדיקת רקמות. האפשרות האחרת דורשת אנטומיה מיומנת שיכול לזהות את הוספות שרירי extraocular. תחת stereomicroscope, זיהוי של הכנסת השרירים האלכסוניות מעולה הנחותה ומסמן את ההיבט הנח ומעולה של הגלובוס. 3 עם אף אחת משיטות ההתמצאות, חשוב לעקוב אחר הדגימה כעינו ימנית או שמאלית. יחד, זה יאפשר התמצאות עולם מדויקת לקראת חתך.

מיקרוגרף אנטומיה של העין; מדורים היסטולוגיים; עדשה, רשתית, קרנית; פרטי שכבת הסלולר.
איור 1. תמונות היסטולוגית עין עכבר afte מרחוק רכישת r. עיניים מאוסות enucleated ידי נתיחה חדה בעקבות קיבעון זלוף עם paraformaldehyde 4%. סעיף א תלמיד אופטי עצבים מוכתמים בHematoxylin וEosin מראה שימור של כל substructures הרקמות. ON, עצב ראייה. (סרגל קנה מידה ירוק = 500 מיקרון) ב 'מבט גבוה יותר גדלה של הרשתית הנורמלית מראה את המבנה שלה מינרית:, תאי הגנגליון ברשתית RGC;, השכבה פנימית plexiform IPL; שכבת INL, פנימית גרעינית;, השכבה חיצונית plexiform OPL; ONL, חיצוני שכבה גרעינית (תא photoreceptor) (חץ); IS, מגזרי photoreceptor פנימיים (ראש חץ); OS, קטעי photoreceptor חיצוניים; RPE, אפיתל הפיגמנט ברשתית; C, דמה עין. (סרגל קנה מידה ירוק = 50 מיקרון) ג בהשוואה לרשתית הנורמלית, העותק הזה הוא דק יותר בשל התנוונות photoreceptor. ONL, IS, ומערכת ההפעלה נעדרת לחלוטין (חץ). (בר סולם ירוק = 50 מיקרון)

"Alt =" איור 2 "/>
איור 2. ביטוי lacZ בעכברים הטרנסגניים. עיניים היו enucleated ידי נתיחה בוטה ושקוע בפתרון 1 מ"ג / מיליליטר X-גל (5 מ"מ K3Fe (CN) 6, 5 המ"מ K4Fe (CN) 6, 2 מ"מ MgCl2, 0.02% NP40 , ו -0.1% deoxycholate נתרן) לילה בשעת 37 ° C. עיניה היו נעוצות ב2% glutaraldehyde formaldehyde/0.2% במשך 30 דקות ומחולקות בmicrotome. X-Gal מוצרים (כחול) תוויות: א ריסי האפיתל, האפיתל של קרנית ב ', וג גנגליון תא שכבת הרשתית (RGC) ברשתית. INL, שכבה פנימית גרעינית; שכבת ONL, חיצונית גרעינית.

מבנה הרשתית; מיקרוגרף אלקטרונים המראה את המקטעים החיצוניים של המוט, תאי RPE, הממברנה של ברוך.
איור 3. מיקרוסקופ אלקטרוני הילוכים של אפיתל הפיגמנט ברשתית (רשתית). לאחר נתיחה ויצירה בוטות של פצע, עיניים היו טבילה קבועה בParaformaldehyde 2.5% / 2.5% בGlutaraldehyde חיץ פוספט נתרן 0.1M. עיניים היו seconקבוע darily ב1% textroxide אוסמיום, בהדרגה מיובשת, ומוטבע בשרף של Spurr. הרקמה נותחה ב 90 ננומטר והניחה על גבי רשתות הימורי נחושת המכוסית בFormvar וצלמה באמצעות מיקרוסקופ אלקטרוני הילוכים. מיקרוסקופ תערוכות, מגזרי photoreceptor חיצוניים של הרשתית, נוירו melanosomes (M) בתוך אפיתל הפיגמנט ברשתית, וקרומו של ברוך.

תמונת מיקרוסקופיה פלואורסצנטית של מבנה ביופילם חיידקי; הגדלה בקנה מידה של 20 מיקרון.
איור 4. תיוג immunohistochemical של dismutase-3 superoxide (ירוק) בזגוגית העכבר. עיניים היו enucleated ידי נתיחה בוטה ועבר קיבוע טבילה בparaformaldehyde 4%. הם גלומים בנפט, ונותח באמצעות microtome. סעיפי רקמות הודגרו עם ארנב SOD3 antiserum polyclonal דילול 1:50. SOD3 ביטוי אובחן באמצעות עיזים נגד ארנב IgG (H + L)-Alexa פלואוריד 488 נוגדנים משניים מצומדות. תיוג של SOD3 מוצג בGREen.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עכברים הטרנסגניים ביותר קיימים במעבדות שלא לבחון את העיניים. טכניקת הווידאו שלנו ממחישה שיטה פשוטה, סטנדרטית להעברת מיומנות כירורגית מרחוק כדי לייעל את רכישת רקמה ממעבדות עם ניסיון מועט עם העיניים. טכניקה זו עוזרת להתגבר על וידאו מכשלה עיקרית בphenotyping תפוקה גבוהה, שהוא השימוש במספר מצומצם של אתרי מומחים בשל שיטות איסוף וקיבוע רקמות שאינם סטנדרטי, שמונעות מחקרים פנוטיפי ומולקולריים השוואתיים משמעותיים. כדי להקים ולקיים בקרת איכות בכל מעבדה מרחוק חדשה וטכנאי, חשוב לכלול את עיניי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר כדי למנוע עיוורון; Bartly ג'Mondino MD, מנהל מכון עיני ז'ול שטיין, אוניברסיטת קליפורניה, ורמירו רמירז-סוליס, ג'קי הלבן, וז'אן Estabel במכון סנגר, קמפוס הגנום Wellcome Trust. מחקר זה תואם את הצהרת ARVO לשימוש בבעלי חיים ברפואת עיניים ומחקר חזותי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
שם חברה מספר קטלוגים תגובות
מלקחי הלבשה מעוקלים Storz Ophthalmics E1408
Mahajan Sharptip הלבשת מלקחיים Storz Ophthalmics E1406 (REF SP7-64520)
מספריים מעוגלים Westcott Storz Ophthalmics E3321 WH
15 ° BD ביבר המייקר Blade קיטון דיקינסון- 374881
0.22 מלקחי תפירה עדין Castroviejo Storz Ophthalmics E1805
0.12 מלקחי קוליברי Storz Ophthalmics 2/132
מחט 30-מד קיטון דיקינסון- 305128
Biohazard מיילר דיג 03-523-4
Parafilm דיג 13-374-10
זכוכית בקבוקוני נצנץ ויטון 4500413033
PBS, 7.4 pH Invitrogen 70011-044
16% Paraformaldehyde מדעי מיקרוסקופ אלקטרונים 15700
2.5% Paraformaldehyde / 2.5% Glutaraldehyde בחיץ פוספט נתרן 0.1M מדעי מיקרוסקופ אלקטרונים 15700 & 16300 מעורב במעבדה
50% Glutaraldehyde מדעי מיקרוסקופ אלקטרונים 16300
Formvar% 0.25 מדעי מיקרוסקופ אלקטרונים 15810
שוטרלגריד משבץ מדעי מיקרוסקופ אלקטרונים M2010-CR
4% tetroxide אוסמיום מדעי מיקרוסקופ אלקטרונים 19140
נוגדן אנטי SOD3 Abcam Ab21974
עיזים נגד ארנב Alexa פלואוריד 488 Invitrogen A11070
השרף של Spurr ההטבעה מדעי מיקרוסקופ אלקטרונים 14300

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Song, B. J., Tsang, S. H., Lin, C. -S. Genetic models of retinal degeneration and targets for gene therapy. Gene Ther. Mol. Biol. 11, 229-262 (2007).
  2. Mahajan, V. B., Mondino, B. J., Tsang, S. H. A high-throughput Mouse Eye Phenomics System. Cold Spring Harbor Laboratories, Mouse Genetics Meeting. , (2010).
  3. Smith, R. S., John, S. W. M., Nishina, P. M., Sundberg, J. P. In Research Methods For Mutant Mice. , CRC Press. Boca Raton, FL. (2002).
  4. Chang, B., Hawes, N. L., Hurd, R. E., Davisson, M. T., Nusinowitz, S., Heckenlively, J. R. Retinal degeneration mutants in the mouse. Vision Res. 42, 517-525 (2002).
  5. Anderson, M. G., Smith, R. S., Hawes, N. L., Zabaleta, A., Chang, B., Wiggs, J. L., John, S. W. Mutations in genes encoding melanosomal proteins cause pigmentary glaucoma in DBA/2J mice. Nat. Genet. 30, 81-85 (2002).
  6. Hawes, N. L., Smith, R. S., Chang, B., Davisson, M., Heckenlively, J. R., John, S. W. Mouse fundus photography and angiography: a catalogue of normal and mutant phenotypes. Mol. Vis. 5, 22-22 (1999).
  7. Won, J., Shi, L. Y., Hicks, W., Wang, J., Hurd, R., Naggert, J. K., Chang, B., Nishina, P. M. Mouse model resources for vision research. J. Ophthalmol. 2011, 391384-391384 (2011).
  8. Pinto, L. H., Vitaterna, M. H., Siepka, S. M., Shimomura, K., Lumayag, S., Baker, M., Fenner, D., Mullins, R. F., Sheffield, V. C., Stone, E. M., Heffron, E., Takahashi, J. S. Results from screening over 9000 mutation-bearing mice for defects in the electroretinogram and appearance of the fundus. Vision. Res. 44, 3335-3345 (2004).
  9. Heckenlively, J. R., Winston, J. V., Roderick, T. H. Screening for mouse retinal degenerations. I. Correlation of indirect ophthalmoscopy, electroretinograms, and histology. Doc. Ophthalmol. 71, 229-239 (1989).
  10. Tsang, S. H., Gouras, P., Yamashita, C. K., Kjeldbye, H., Fisher, J., Farber, D. B., Goff, S. P. Retinal degeneration in mice lacking the gamma subunit of the rod cGMP phosphodiesterase. Science. 272, 1026-1029 (1996).
  11. Tsang, S. H., Woodruff, M. L., Jun, L., Mahajan, V., Yamashita, C. K., Pedersen, R., Lin, C. S., Goff, S. P., Rosenberg, T., Larsen, M., Farber, D. B., Nusinowitz, S. Transgenic mice carrying the H258N mutation in the gene encoding the beta-subunit of phosphodiesterase-6 (PDE6B) provide a model for human congenital stationary night blindness. Hum. Mutat. 28, 243-254 (2007).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Tissue FixationRemote PhenotypingSurgical SpecimenOptic NerveConnective TissueScintillation VialParafilm PackagingBubble Wrap BagLiquid Laboratory Shipping

מאמרים קשורים