שחרור נוירוטרנסמיטר הדמיה באמצעות נוירוטרנסמיטר מבוסס תאים מדווחים מהונדסים פלואורסצנטיים

תקציר

מקור: Lacin, E., et al. בניית מדווחים מהונדסים פלואורסצנטיים מבוססי תאים (CNiFERs) לזיהוי אופטי של נוירוטרנסמיטורים in vivo. J. Vis. Exp. (2016)

סרטון זה מדגים טכניקה להדמיית שחרור נוירוטרנסמיטר in vivo באמצעות מדווחים מהונדסים פלואורסצנטיים מבוססי תאים (CNiFERs), תאי דיווח מיוחדים שהוזרקו מראש לקליפת העכבר. העכבר ממוקם תחת מיקרוסקופ של שני פוטונים, ומאפשר הדמיה של איתות סידן המושרה על ידי נוירוטרנסמיטר באמצעות פליטת פלואורסצנטיות. השיטה ממנפת קשירת נוירוטרנסמיטורים לקולטנים מצומדים לחלבון G ב-CNiFERs, ומפעילה שחרור סידן ופלואורסצנטיות כדי לזהות פעילות נוירוטרנסמיטר בזמן אמת.

פרוטוקול

כל ההליכים הכוללים מודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ומועצת הביקורת הווטרינרית של JoVE.

1. השתלת CNiFER בקליפת המוח של העכבר

1. עקר את כל הכלים הכירורגיים בחיטוי לפני הניתוח. הכינו שדה חצי סטרילי לניתוח על ידי ניגוב באתנול 70% והנחת חיתול מעבדה נקי.
2. הכן את צינור ההזרקה CNiFER על ידי משיכת נימי זכוכית (קוטר פנימי של 0.53 מ"מ) על מושך אלקטרודות אנכי. השתמש בזוג מלקחיים עדינים מס' 5 כדי לשבור את קצה האלקטרודה לקוטר של ~40 מיקרומטר.
   הערה: זה מושג בצורה הטובה ביותר תחת מיקרוסקופ זום סטריאו עם גרטיקולה.
3. להרדים עכבר C57BL/6 בוגר (יום 60-90) לאחר הלידה עם איזופלורן: 4% (v/v) לאינדוקציה ו-1.5 עד 2.0% (v/v) לתחזוקה. השתמש בצביטת זנב או בוהן כדי לוודא שהעכבר מורדם לחלוטין.
   הערה: צבט מחדש מעת לעת והעריך את עוויתות השפם במהלך הניתוח כדי להעריך מחדש את עומק ההרדמה.
4. יש לכסות את העיניים במשחה עיניים למניעת התייבשות. הרכיב את העכבר במסגרת סטריאוטקסית עם מוטות אוזניים. שמור על טמפרטורת גוף העכבר על 37 מעלות צלזיוס באמצעות כרית חום המווסתת על ידי בדיקה רקטלית.
5. לגלח שטח של כ -5 מ"מ על 12 מ"מ עם מכונת גילוח חשמלית לבעלי חיים. יש למרוח בטדין ואחריו 70% (v/v) איזופרופנול. השתמש בלהב אזמל כדי לחתוך ולהסיר את העור מעל פני הגולגולת. השתמש בלהב אזמל כדי להסיר את הפריאוסטאום מפני השטח של הגולגולת. חשוף ונקה את פני הגולגולת, כמתואר עבור ניתוח סטריאוטקסי.
6. הורד צינור זכוכית ריק לברגמה ורשום את הקואורדינטות הקדמיות-אחוריות (A/P) והמדיו-לטרליות (M/L). בהתייחס לאטלס מוח העכבר, חשב את מיקום אתר ההזרקה. העבר את הפיפט לאתר המטרה וסמן את הגולגולת להיווצרות חלון לאחר מכן.
   הערה: אתר ההזרקה והחלון תלויים באזור הנחקר ובהתפלגות ההקרנות המשחררות נוירוטרנסמיטר או פפטיד בקליפת המוח. לדוגמה, בפרסום שפורסם לאחרונה, הקואורדינטות הסטריאוטקסיות +1.0 עד +2.0 מ"מ A/P ו-+1.0 עד +2.0 מ"מ M/L שימשו להזרקת תאי CNiFER לקליפת המוח הקדמית להדמיה in vivo של שחרור דופמין במהלך התניה קלאסית.
7. יוצרים חלון גולגולת דק בגודל 2 מ"מ על 3 מ"מ.
   הערה: עובי העצם בחלון צריך להיות 15-20 מיקרומטר. הכתמים הלבנים הקטנים בעצם לא צריכים להיות גלויים כאשר משטח הגולגולת מרטיב, אם העצם מדוללת מספיק.
8. הניחו ספוג מלאכותי בנוזל המוח השדרתי (ACSF) על החלון כדי לשמור על לחותו בזמן הכנת התאים להזרקה.
9. קציר את שיבוט CNiFER שגדל בבקבוק T75 עד ~80% מפגש. שאפו את המדיה ושטפו את התאים במי מלח סטריליים עם חוצץ פוספט (PBS). הערה: טריפסין מושמט בשלבים אלה.
10. הסר PBS והשתמש ב-10 מ"ל ACSF כדי לעקור תאים מתחתית הבקבוק. טריטורציה של תאים כדי להפריד גושי תאים. צנטריפוגה ולהשעות מחדש את הגלולה ב-100 מיקרוליטר של ACSF. צנטריפוגה למשך 30 שניות ב-1,400 x גרם ולהסיר את הסופרנטנט, ולהשאיר כדור מכוסה ב-ACSF. שלב זה משאיר גוש תאים בתרחיף.
11. מלא מחדש את צינור ההזרקה שהוכן בשלב 1.2 בשמן מינרלי, טען את הפיפט על ננו-מזרק וקדם את הבוכנה כדי להוציא חרוז שמן קטן. שים 5 מיקרוליטר של תרחיף תאי CNiFER על רצועת סרט פרפין מפלסטיק ליד תכשיר העכבר. משוך את ה-CNiFERs או תאי CNiFER בקרה לתוך הפיפטה הנמשכת.
12. העבר את הפיפטה לקואורדינטות המטרה X ו-Y, כלומר, A/P ו-M/L שצוינו בשלב 1.5. הורידו את הפיפטה, חודרים את הגולגולת הדלילה, והמשיכו לעומק של ~200-400 מיקרומטר מתחת לפני הגולגולת, כדי להפקיד תאי CNiFER בשכבות 2/3 של קליפת המוח.
13. הזרקו ~4.6 nl של תאי CNiFER באתר העמוק ביותר עם הננו-מזרק, שימו לב לתנועה בממשק השמן והתא ולאחר מכן המתינו 5 דקות עד שהתאים יתפזרו. משוך את הפיפטה ~ 100 מיקרומטר והזריק עוד ~ 4.6 nl של תאי CNiFER, המתן 5 דקות. לאחר מכן משוך את הפיפטה לאט ובעדינות כדי למנוע זרימה חוזרת של ה-CNiFERs. חזור על הזרקות באתר סמוך אחד או יותר.
14. חזור על שלבי ההזרקה 1.8-1.12 עם תאי בקרה HEK293 (כלומר, שיבוט HEK293/TN-XXL/Gqi5 חסר קולטן מצומד לחלבון G [GPCR]). הפרד את אתרי הזרקת ה-CNiFER ותאי הבקרה ב-~200 מיקרומטר.
15. לאחר השלמת השתלת התאים, שטפו את חלון הגולגולת הדקה עם ACSF והמתינו לייבוש הגולגולת. מרחו טיפה של דבק ציאנואקרילט (ראו חומרים) על החלון והניחו במהירות זכוכית כיסוי סטרילית חתוכה מראש על גבי הדבק. דחף בעדינות את זכוכית הכיסוי אל הגולגולת למשך מספר שניות. תן לדבק להתייבש במשך 2 דקות.
16. אטמו את שולי זכוכית הכיסוי במלט דנטלי וצרו באר סביב החלון כדי להחזיק מים למטרת הטבילה.
17. לשיתוק ראש העכבר במהלך ההדמיה, חבר מוט ראש שנבנה בהתאמה אישית עם טיפה קטנה של דבק ציאנואקרילט מאחורי החלון. הניחו לדבק להתייבש היטב ולאחר מכן הוסיפו מלט דנטלי נוסף כדי לחזק עוד יותר את מוט הראש שנבנה בהתאמה אישית.
18. מכסים את שאר משטח הגולגולת, למעט החלון, בשכבת מלט דנטלי. וודאו ששולי העור מכוסים במלט ותנו לו להתייבש במשך 20 דקות.
19. לאחר הניתוח, יש להפסיק את מתן האיזופלורן ולהשאיר את העכבר על כרית חימום בכלוב עד שהוא מתאושש לחלוטין מההרדמה. יש להזריק 5% גלוקוז במי מלח (תת עורי [s.c.]) להחזרת נוזלים ו-0.05 עד 0.1 מ"ג/ק"ג בופרנורפין (תוך-צפק, שחרור מיידי) לשיכוך כאבים לאחר הניתוח.
    הערה: כדי למזער את התגובה האימונולוגית הפוטנציאלית ל-CNiFERs אנושיים, יש להזריק לעכבר מדי יום 20 מיקרוליטר/100 גרם ציקלוספורין (i.p.) החל מהיום שלפני הזרקת CNiFERs.
20. החזירו את העכבר לכלוב הביתי שלו למזון ומים.

2. הדמיה in vivo של שיבוטי CNiFER

הערה: הדמיה חיה מתבצעת עם עכברים באמצעות מיקרוסקופ דו-פוטוני ומנגנון קבוע לראש. אין צורך בהרדמה במהלך מפגשי הדמיה. בעת הדמיית בעלי חיים במצב ערות, הגבל את משענת הראש לכמה שעות בלבד בכל פעם כדי להפחית את רמות הלחץ. החזירו את בעל החיים לכלוב הביתי שלו בין מפגשי הדמיה למזון ומים. הלחץ הפוטנציאלי ממוזער על ידי החשכת אורות החדר והחלק המקיף של העכבר במארז.

1. ביום שלאחר הניתוח, הרכיב את העכבר על פלטפורמת הדמיה על ידי הברגת מוט המתכת המושתל על הגולגולת למסגרת קיבוע הראש.
   הערה: בעת הדמיית עכברים ערים, סשן ההדמיה לא יעלה על מספר שעות בשל הלחץ הפוטנציאלי הנגרם על ידי התקן משענת הראש.
2. הנח את פלטפורמת ההדמיה עם העכבר המרוסן בראש במיקרוסקופ הדמיה דו-פוטוני המצויד במטרות טבילה במים של 10X (0.30 NA) ו-40X (0.80 NA).
3. הכנס קוביית מסנן להדמיית העברת אנרגיה בתהודה פלואורסצנטית (FRET) (חלבון פלואורסצנטי ציאן משופר [eCFP] וסיטרין) בעלת מראה דיכרואית ב-505 ננומטר ומסנני מעביר-פס המשתרעים על פני 460 ננומטר עד 500 ננומטר למדידת eCFP ו-520 ננומטר עד 560 ננומטר למדידת סיטרין.
4. הוסף ACSF לחלון הגולגולת הדליל המכיל באר והורד את מטרת הטבילה במים לתוך ה-ACSF. השתמש בעינית בשילוב עם מנורת כספית וקוביית מסנן חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) כדי לאתר את פני השטח של קליפת המוח וכלי הדם מתחת לחלון.
   הערה: דפוס כלי הדם מסייע לאתר ולצלם את אותו אזור במהלך ימי הדמיה חוזרים ונשנים. עבור למטרת הטבילה במים פי 40 כדי לאתר CNiFERs על ידי התמקדות ידנית במשטח קליפת המוח מעל התאים באמצעות קוביית מסנן GFP ומנורת כספית.
5. הגדר להדמיה של שני פוטונים. בחר את נתיב האור המתאים להדמיה של שני פוטונים. עבור מערכת מסחרית טיפוסית, השתמש בתוכנה כדי לעבור למצב הדמיה של שני פוטונים ולהפנות את האור לצינורות מכפיל הפוטו (PMTs) בגלאים שאינם נסרקים. הפעל את הלייזר הפועם של פמטו-שנייה אינפרא אדום קרוב, בחר אורך גל של 820 ננומטר והגדרת הספק של 5-15%.
   הערה: הספק של 5% מספק בדרך כלל ~25 mW בדגימה.
6. הגדר את מתח PMT1 ו-PMT2 קרוב לערך המקסימלי, בדרך כלל 700-1,000 V בהתאם ל-PMT. הגדר את הרווח ל-1 עבור כל ערוץ ואפס את מיקום z עבור המטרה.
7. הורד את המטרה ~100 עד 200 מיקרומטר מהמשטח הקורטיקלי והתחל את סריקת ה-xy. כוונן את עוצמת הלייזר, הרווח ומתח ה-PMT עבור כל ערוץ, כלומר, eCFP וסיטרין, כדי לייעל את יחס האות לרעש של הקרינה CNiFER.
8. השתמש בתכונת הזום בתוכנה כדי להגביל את התמונה לאזור המכיל את תאי CNiFER כמו גם אזור רקע. השתמש בקצב סריקה שאינו איטי ממסגרת אחת כל 2 שניות (0.5 הרץ) ב- 4 μs לפיקסל. התאם את ממוצע הקו ליחס אות לרעש מתאים, למשל, ממוצע קלמן 2 שורות.
9. צייר אזור עניין (ROI) סביב תאי CNiFER, המקיף כ-3 עד 4 תאים לכל מישור. הגדר ניתוח בזמן אמת של עוצמות ממוצעות של החזר ROI. התחל ברכישה כדי לנטר את הקרינה של CNiFER לאורך זמן.
10. אסוף פלואורסצנטיות מ-CNiFERs לפני ובמהלך מניפולציות ניסיוניות, למשל, גירוי חשמלי, גירוי Channelrhodopsin-2 (ChR2), התנהגות, כפי שנקבע על ידי המשתמש.
11. בסיום ניסוי ההדמיה, החזירו את העכבר לכלוב הביתי שלו. חזור על ההדמיה לאורך ימים, לפי הצורך. בעת הדמיה מחדש התאים מתייחסים לתמונת כלי הדם בהגדלה נמוכה שנרכשה בעבר כדי להתמצא בחזרה לאותו שדה הדמיה (שלב 2.4).
    הערה: ניתן לדמות CNiFERs מושתלים למשך 7 ימים לפחות.

חומרים