מערכת מיקרו-הזרקה מבוססת מיקרופלואידית לעירוי תרופות משולב ואלקטרופיזיולוגיה

תקציר

מקור: Vanegas, M. I., et al. מערכת מיקרו-הזרקה לעירוי תרופות משולב ואלקטרופיזיולוגיה. J. Vis. Exp. (2019)

סרטון זה מדגים מכשיר מיקרופלואידית מבוסס מיקרואלקטרודה המספק תמיסת תרופות דרך צינור נימי, תוך שימוש בתמיסת סמן על בסיס שמן למעקב מדויק אחר נפח ומאפשר הקלטה עצבית ועירוי תרופות בו זמנית.

פרוטוקול

כל ההליכים הכוללים מודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ומועצת הביקורת הווטרינרית של JoVE.

1. בניית המיקרו-הזרקה לגירוי והקלטה (איור 1a)

1. מדוד את אורך הצינורית והגשושית (בדוגמה זו, ננו-חיישן). הגשושית חייבת להיות ארוכה יותר מהצינורית באורך שהיא אמורה לבלוט מקצה הצינורית (תלוי בעיצוב הבדיקה), בתוספת כ -2 ס"מ.
2. תחת זכוכית מגדלת או מיקרוסקופ (הגדלה של ~פי 10), טען את הגשושית לתוך הצינורית; במידת האפשר עדיף טעינה חוזרת כדי להגן על קצה הבדיקה.
   הערה: שלב זה, המבוצע באופן ידני, הוא מאתגר. מומלץ להתאמן עם מיקרואלקטרודה תחת זכוכית מגדלת לפני שמנסים עם בדיקה ניסיונית.
3. העבירו את הצינורית (המכילה את הבדיקה) דרך הטבעת העליונה, צומת ה-T והטבעת התחתונה.
   1. אם הגשושית היא רק חוט בודד ללא חיבורים, טען אותו מחדש לתוך הצינורית והכנס את המכלול לצומת ה-T מהטבעת התחתונה. יש למקם את החלק העליון של הצינורית (הצד השטוח) באמצע צומת ה-T, בתוך החלק התחתון אך לא את הטבעת העליונה. הגשושית הניסיונית או החיישן הביולוגי צריכים לבלוט מעל החלק העליון של הטבעת.
      הערה: ניתן לייצר טבעות בהתאמה אישית גם על ידי קידוח חור בתקעי הטבעת באמצעות מקדחי מיקרו, כאשר גודל החור מבוסס על הקוטר הדרוש להידוק הצינורית לצומת T.
4. השתמש במפתח הברגים כדי להדק את הטבעות בחלק העליון והתחתון של צומת ה-T. אין להדק יתר על המידה. ניתן להוסיף חתיכת צינור קטנה לחיזוק תמיכת האלקטרודה בתוך הטבעת העליונה.
5. הלחמת סיכות זהב לכל אחד ממסופי הבדיקה (אות, הארקה וכו'), בהתאם למפרט הבדיקה.
6. התאם את המיקום היחסי של הגשושית והצינורית. מדוד את המרחק שהגשושית בולטת מהצינורית בהגדלה, והתאם ידנית מהקצה העליון (בדיקה יכולה להחליק בחופשיות בתוך טבעות).
7. הוסף דבק אפוקסי בין סיכות הזהב לטבעת העליונה כדי לחבר את הגשושית לטבעת.
8. נתק את הברגים העליונים כדי למשוך את הגשושית בתוך הצינורית. אשר חזותית שהגשושית נמצאת במלואה בתוך הצינורית בהגדלה.
9. חבר את המזרק למיקרו-כונן.

2. בניית המיקרו-הזרקה לעירוי תרופות (איור 1 ב)

1. חבר את הקצה ה"לא משופע" או השטוח של הצינורית לתחתית צומת ה-T באמצעות טבעת. השתמש במפתח הברגים כדי להדק את הטבעת.
2. חבר חתיכה קטנה של צינור נימי (~1.5 ס"מ) לחלק העליון של צומת ה-T על ידי העברתו דרך הטבעת הסטנדרטית. הדק בעזרת מפתח ברגים.
3. טען מחדש את המיקרו-אלקטרודה דרך הצינורות הנימים, צומת T, הצינורית והטבעות המתאימות.
4. וודאו כי הקצה האחורי של האלקטרודה בולט פחות מ-1 ס"מ מגב הצינור הנימים, וקצה האלקטרודה בולט מהצינורית במרחק הרצוי בצד התחתון. ניתן לכוונן את מיקום האלקטרודה באופן ידני מהקצה העליון.
5. הלחמו סיכת זהב למסוף המיקרואלקטרודה.
6. הוסף דבק אפוקסי בין סיכת הזהב לטבעת העליונה כדי לחבר את המיקרואלקטרודה לטבעת.
7. נתק את הברגים העליונים כדי למשוך את הגשושית בתוך הצינורית. אשר חזותית שהמיקרואלקטרודה נסוגה במלואה לתוך הצינורית.

3. בניית המעגל המיקרופלואידי (איור 2)

1. הנח לוח אב-טיפוס על משטח יציב. הנח את שני השסתומים התלת-כיווניים במקביל לצדדים הארוכים ביותר של לוח הלחם, בערך 6 אינץ'. בנפרד, עם יציאה אחת (זו שתמיד פתוחה) פונה זו לזו. השתמש בברגים כדי לקבע את השסתומים ללוח הלחם.
2. הניחו סרגל ליד השסתומים (כדי למדוד ולעקוב אחר תנועת הנוזלים בתוך הצינור הנימים).
3. טען תערובת של שמן צמיגות נמוכה 1:1 וצבעי מאכל (טוש) לתוך המזרק האטום לגז והניח במשאבת הסמן. חתוך חתיכה אחת של צינורות נימיים, והשתמש בטבעות סטנדרטיות ובמחברי Luer-lock כדי לחבר את המזרק לאחת היציאות בשסתום הכניסה. זהו "קו הסמן".
4. חותכים חתיכה קצרה של צינור נימי ל"קו הסרגל". השתמש בטבעות סטנדרטיות כדי להדק ליציאות הפונות של השסתומים.
5. חותכים שתי חתיכות ארוכות יותר של צינורות נימיים כדי לחבר את שסתום הפלט למיקרו-הזרקה, ולחבר את משאבת התרופות לשסתום הכניסה (השתמש בטבעות סטנדרטיות).
   הערה: אורך שני הקווים הללו תלוי במערך הניסוי, האחד חייב להיות ארוך מספיק כדי להגיע ממנגנון העירוי לבעל החיים, והשני ממשאבת התרופות לשסתום הכניסה. השתמש באבן מבקעת כדי לחתוך את הצינור הנימים.

4. הרכבת ה-Microinjectrode ל-Microdrive (איור 3)

1. ודא שהמיקרו-אלקטרודה/בדיקה הניסיונית נסוגה בצינורית לפני ההרכבה.
   הערה: צינור ההנחיה צריך להיות במצב במיקרו-כונן.
2. חבר מתאם בהתאמה אישית למיקרו-הזרקה.
3. טען למעלה את המיקרו-הזרקה דרך צינור ההנחיה והדק אותו למתאם באמצעות ברגים.
4. מדוד את מיקום המיקרו-כונן (עומק) שבו המיקרו-הזרקה בולטת מצינור המנחה, ולאחר מכן משוך אותה ~1 ס"מ כדי להתכונן להחדרה.
5. עבור ניסויי מיקרו-עירוי, חבר את "קו המוח" לפתח צומת ה-T שאינו בשימוש של המיקרואלקטרודה. השתמש בטבעת רגילה והדק אותה בעזרת מפתח ברגים.

5. שטיפה והכנה של המערכת המיקרופלואידית

1. מקם את המיקרו-כונן עם המיקרו-הזרקה מעל פסולת.
2. טען כלורהקסידין (למשל, נולבסאן, מומס ב-20 גרם/ליטר) לתוך המזרק האטום לגז בנפח 1 מ"ל והנח אותו במשאבת התרופות. סובב את כיוון הזרימה של השסתומים כך שהנוזל יעבור ממשאבת הסמים דרך השסתום לקו השסתום והחוצה מ"קו המוח".
3. שטפו את המעגל עם כלורהקסידין באמצעות קצב זרימה נמוך (50-200 מיקרוליטר לדקה) למשך 10 דקות לפחות. חזור על שלבים 5.2 עד 5.3 עם מי מלח סטריליים ולאחר מכן אוויר.
   הערה: חשוב לבדוק אם יש נזילות בשלב זה. מרחו בעדינות מגבונים נטולי מוך בצמתים כדי לסייע בחשיפת דליפות נוזלים דרך הטבעות.
4. טען את התרופה במזרק אטום לגז 500 מיקרוליטר, דחוס את האוויר ולאחר מכן הכניס למשאבת התרופות. זרום במהירות של 50 מיקרוליטר לדקה עד שזורמות כמה טיפות מהמיקרו-הזרקה.
5. משרים את צינור ההנחיה בכלורהקסידין (מומס ב-20 גרם/ליטר) למשך 15 דקות.
6. סובב את כיוון שסתום הפלט לכיוון "קו השטיפה". קדם את משאבת הסמן עד שנצפה קצה ברור של צבע ושמן על קו הסרגל. וודאו שתמיד יש שמן בין התרופה לצבע על מנת לא לערבב את שני החומרים המסיסים במים ולאבד את הקצה החד ביניהם. סמן את מיקום ההתחלה של קו שמן/צבע זה (בעזרת פיסת סרט או טוש).
7. סובב את כיוון שסתום הפלט לכיוון קו המוח.

6. ביצוע הקלטה או ניסוי עירוי

הערה: שלבי הטיפול בבעלי חיים ישתנו בהתאם למעבדה ולניסוי. יש לבצע את השלבים הבאים לאחר ההגדרה הכירורגית הדרושה וההכנה לחשיפת הדורה. לאחר הניסוי, יש לבצע את כל השלבים הדרושים לאחר ההליך בהתאם לפרוטוקולים שאושרו על ידי המוסד.

1. חבר את המיקרו-כונן לתא ההקלטה. הורד את צינור ההנחיה כדי לחדור לדורה.
   הערה: צינור ההנחיה לא אמור לחדור רחוק יותר מהדורה על מנת למנוע נזק לקליפת המוח.
2. הורד את המיקרו-הזרקה לכ-2 מ"מ מעל המקום לצורך הקלטה/הזרקה במוח.
3. הדק את הטבעת העליונה (מיקרואלקטרודה/חיישן ביולוגי בולט) וחבר את פיני הזהב למערכת ההקלטה. המשך לקדם את המיקרו-הזרקה לאתר המטרה.
   הערה: זכור לכלול את המרחק שהמיקרו-אלקטרודה משתרעת מעבר לצינורית בחישובים.
4. לניסויי עירוי, השתמש במשאבת המיקרו-מזרק הידנית כדי להזיז את עמוד השמן ב-1 ס"מ כל 3 דקות (~60 ננוטר/דקה). לאחר החדרת הנפח הרצוי, העבר את שסתום הפלט לכיוון קו ההדחה.
   הערה: הנפח המוזרק ישתנה בהתאם למין הדגם ולאזור המוח הממוקד. קצב זרימה מהיר יותר עלול לפגוע ברקמות עצביות.
5. לאחר השלמת הניסויים, החזר את המיקרו-הזרקה בתוך צינור ההנחיה (השאר את הגשושית בולטת). ואז הסר את המיקרו-כונן לשטיפה. שטוף את המערכת המיקרופלואידית כדי להתכונן לשימוש חוזר. הערה: מניסיוננו, המיקרו-הזרקה תחזיק מעמד למספר שימושים אם ננקט טיפול נאות. איכות ההקלטה האלקטרופיזיולוגית יורדת מהר יותר מיכולת ההזרקה.

תוצאות

איור 1: ייצור צעד אחר צעד של מיקרו-הזרקה. (א) תצורה לשימוש ללא תלות במערכת מיקרופלואידית. הצינורית והגשושית נמדדים על מנת לאשר שניתן לבלוט את קצה הגשושית באורך הרצוי (למשל, 150 מיקרומטר). הגשושית נטענת מלפנים לתוך הצינורית. ה...

חומרים