מערכת מיקרו-הזרקה מבוססת מיקרופלואידית לעירוי תרופות משולב ואלקטרופיזיולוגיה

תקציר

מקור: Vanegas, M. I., et al. מערכת מיקרו-הזרקה לעירוי תרופות משולב ואלקטרופיזיולוגיה. J. Vis. Exp. (2019)

סרטון זה מדגים מכשיר מיקרופלואידית מבוסס מיקרואלקטרודה המספק תמיסת תרופות דרך צינור נימי, תוך שימוש בתמיסת סמן על בסיס שמן למעקב מדויק אחר נפח ומאפשר הקלטה עצבית ועירוי תרופות בו זמנית.

פרוטוקול

כל ההליכים הכוללים מודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ומועצת הביקורת הווטרינרית של JoVE.

1. בניית המיקרו-הזרקה לגירוי והקלטה (איור 1a)

1. מדוד את אורך הצינורית והגשושית (בדוגמה זו, ננו-חיישן). הגשושית חייבת להיות ארוכה יותר מהצינורית באורך שהיא אמורה לבלוט מקצה הצינורית (תלוי בעיצוב הבדיקה), בתוספת כ -2 ס"מ.
2. תחת זכוכית מגדלת או מיקרוסקופ (הגדלה של ~פי 10), טען את הגשושית לתוך הצינורית; במידת האפשר עדיף טעינה חוזרת כדי להגן על קצה הבדיקה.
   הערה: שלב זה, המבוצע באופן ידני, הוא מאתגר. מומלץ להתאמן עם מיקרואלקטרודה תחת זכוכית מגדלת לפני שמנסים עם בדיקה ניסיונית.
3. העבירו את הצינורית (המכילה את הבדיקה) דרך הטבעת העליונה, צומת ה-T והטבעת התחתונה.
   1. אם הגשושית היא רק חוט בודד ללא חיבורים, טען אותו מחדש לתוך הצינורית והכנס את המכלול לצומת ה-T מהטבעת התחתונה. יש למקם את החלק העליון של הצינורית (הצד השטוח) באמצע צומת ה-T, בתוך החלק התחתון אך לא את הטבעת העליונה. הגשושית הניסיונית או החיישן הביולוגי צריכים לבלוט מעל החלק העליון של הטבעת.
      הערה: ניתן לייצר טבעות בהתאמה אישית גם על ידי קידוח חור בתקעי הטבעת באמצעות מקדחי מיקרו, כאשר גודל החור מבוסס על הקוטר הדרוש להידוק הצינורית לצומת T.
4. השתמש במפתח הברגים כדי להדק את הטבעות בחלק העליון והתחתון של צומת ה-T. אין להדק יתר על המידה. ניתן להוסיף חתיכת צינור קטנה לחיזוק תמיכת האלקטרודה בתוך הטבעת העליונה.
5. הלחמת סיכות זהב לכל אחד ממסופי הבדיקה (אות, הארקה וכו'), בהתאם למפרט הבדיקה.
6. התאם את המיקום היחסי של הגשושית והצינורית. מדוד את המרחק שהגשושית בולטת מהצינורית בהגדלה, והתאם ידנית מהקצה העליון (בדיקה יכולה להחליק בחופשיות בתוך טבעות).
7. הוסף דבק אפוקסי בין סיכות הזהב לטבעת העליונה כדי לחבר את הגשושית לטבעת.
8. נתק את הברגים העליונים כדי למשוך את הגשושית בתוך הצינורית. אשר חזותית שהגשושית נמצאת במלואה בתוך הצינורית בהגדלה.
9. חבר את המזרק למיקרו-כונן.

2. בניית המיקרו-הזרקה לעירוי תרופות (איור 1 ב)

1. חבר את הקצה ה"לא משופע" או השטוח של הצינורית לתחתית צומת ה-T באמצעות טבעת. השתמש במפתח הברגים כדי להדק את הטבעת.
2. חבר חתיכה קטנה של צינור נימי (~1.5 ס"מ) לחלק העליון של צומת ה-T על ידי העברתו דרך הטבעת הסטנדרטית. הדק בעזרת מפתח ברגים.
3. טען מחדש את המיקרו-אלקטרודה דרך הצינורות הנימים, צומת T, הצינורית והטבעות המתאימות.
4. וודאו כי הקצה האחורי של האלקטרודה בולט פחות מ-1 ס"מ מגב הצינור הנימים, וקצה האלקטרודה בולט מהצינורית במרחק הרצוי בצד התחתון. ניתן לכוונן את מיקום האלקטרודה באופן ידני מהקצה העליון.
5. הלחמו סיכת זהב למסוף המיקרואלקטרודה.
6. הוסף דבק אפוקסי בין סיכת הזהב לטבעת העליונה כדי לחבר את המיקרואלקטרודה לטבעת.
7. נתק את הברגים העליונים כדי למשוך את הגשושית בתוך הצינורית. אשר חזותית שהמיקרואלקטרודה נסוגה במלואה לתוך הצינורית.

3. בניית המעגל המיקרופלואידי (איור 2)

1. הנח לוח אב-טיפוס על משטח יציב. הנח את שני השסתומים התלת-כיווניים במקביל לצדדים הארוכים ביותר של לוח הלחם, בערך 6 אינץ'. בנפרד, עם יציאה אחת (זו שתמיד פתוחה) פונה זו לזו. השתמש בברגים כדי לקבע את השסתומים ללוח הלחם.
2. הניחו סרגל ליד השסתומים (כדי למדוד ולעקוב אחר תנועת הנוזלים בתוך הצינור הנימים).
3. טען תערובת של שמן צמיגות נמוכה 1:1 וצבעי מאכל (טוש) לתוך המזרק האטום לגז והניח במשאבת הסמן. חתוך חתיכה אחת של צינורות נימיים, והשתמש בטבעות סטנדרטיות ובמחברי Luer-lock כדי לחבר את המזרק לאחת היציאות בשסתום הכניסה. זהו "קו הסמן".
4. חותכים חתיכה קצרה של צינור נימי ל"קו הסרגל". השתמש בטבעות סטנדרטיות כדי להדק ליציאות הפונות של השסתומים.
5. חותכים שתי חתיכות ארוכות יותר של צינורות נימיים כדי לחבר את שסתום הפלט למיקרו-הזרקה, ולחבר את משאבת התרופות לשסתום הכניסה (השתמש בטבעות סטנדרטיות).
   הערה: אורך שני הקווים הללו תלוי במערך הניסוי, האחד חייב להיות ארוך מספיק כדי להגיע ממנגנון העירוי לבעל החיים, והשני ממשאבת התרופות לשסתום הכניסה. השתמש באבן מבקעת כדי לחתוך את הצינור הנימים.

4. הרכבת ה-Microinjectrode ל-Microdrive (איור 3)

1. ודא שהמיקרו-אלקטרודה/בדיקה הניסיונית נסוגה בצינורית לפני ההרכבה.
   הערה: צינור ההנחיה צריך להיות במצב במיקרו-כונן.
2. חבר מתאם בהתאמה אישית למיקרו-הזרקה.
3. טען למעלה את המיקרו-הזרקה דרך צינור ההנחיה והדק אותו למתאם באמצעות ברגים.
4. מדוד את מיקום המיקרו-כונן (עומק) שבו המיקרו-הזרקה בולטת מצינור המנחה, ולאחר מכן משוך אותה ~1 ס"מ כדי להתכונן להחדרה.
5. עבור ניסויי מיקרו-עירוי, חבר את "קו המוח" לפתח צומת ה-T שאינו בשימוש של המיקרואלקטרודה. השתמש בטבעת רגילה והדק אותה בעזרת מפתח ברגים.

5. שטיפה והכנה של המערכת המיקרופלואידית

1. מקם את המיקרו-כונן עם המיקרו-הזרקה מעל פסולת.
2. טען כלורהקסידין (למשל, נולבסאן, מומס ב-20 גרם/ליטר) לתוך המזרק האטום לגז בנפח 1 מ"ל והנח אותו במשאבת התרופות. סובב את כיוון הזרימה של השסתומים כך שהנוזל יעבור ממשאבת הסמים דרך השסתום לקו השסתום והחוצה מ"קו המוח".
3. שטפו את המעגל עם כלורהקסידין באמצעות קצב זרימה נמוך (50-200 מיקרוליטר לדקה) למשך 10 דקות לפחות. חזור על שלבים 5.2 עד 5.3 עם מי מלח סטריליים ולאחר מכן אוויר.
   הערה: חשוב לבדוק אם יש נזילות בשלב זה. מרחו בעדינות מגבונים נטולי מוך בצמתים כדי לסייע בחשיפת דליפות נוזלים דרך הטבעות.
4. טען את התרופה במזרק אטום לגז 500 מיקרוליטר, דחוס את האוויר ולאחר מכן הכניס למשאבת התרופות. זרום במהירות של 50 מיקרוליטר לדקה עד שזורמות כמה טיפות מהמיקרו-הזרקה.
5. משרים את צינור ההנחיה בכלורהקסידין (מומס ב-20 גרם/ליטר) למשך 15 דקות.
6. סובב את כיוון שסתום הפלט לכיוון "קו השטיפה". קדם את משאבת הסמן עד שנצפה קצה ברור של צבע ושמן על קו הסרגל. וודאו שתמיד יש שמן בין התרופה לצבע על מנת לא לערבב את שני החומרים המסיסים במים ולאבד את הקצה החד ביניהם. סמן את מיקום ההתחלה של קו שמן/צבע זה (בעזרת פיסת סרט או טוש).
7. סובב את כיוון שסתום הפלט לכיוון קו המוח.

6. ביצוע הקלטה או ניסוי עירוי

הערה: שלבי הטיפול בבעלי חיים ישתנו בהתאם למעבדה ולניסוי. יש לבצע את השלבים הבאים לאחר ההגדרה הכירורגית הדרושה וההכנה לחשיפת הדורה. לאחר הניסוי, יש לבצע את כל השלבים הדרושים לאחר ההליך בהתאם לפרוטוקולים שאושרו על ידי המוסד.

1. חבר את המיקרו-כונן לתא ההקלטה. הורד את צינור ההנחיה כדי לחדור לדורה.
   הערה: צינור ההנחיה לא אמור לחדור רחוק יותר מהדורה על מנת למנוע נזק לקליפת המוח.
2. הורד את המיקרו-הזרקה לכ-2 מ"מ מעל המקום לצורך הקלטה/הזרקה במוח.
3. הדק את הטבעת העליונה (מיקרואלקטרודה/חיישן ביולוגי בולט) וחבר את פיני הזהב למערכת ההקלטה. המשך לקדם את המיקרו-הזרקה לאתר המטרה.
   הערה: זכור לכלול את המרחק שהמיקרו-אלקטרודה משתרעת מעבר לצינורית בחישובים.
4. לניסויי עירוי, השתמש במשאבת המיקרו-מזרק הידנית כדי להזיז את עמוד השמן ב-1 ס"מ כל 3 דקות (~60 ננוטר/דקה). לאחר החדרת הנפח הרצוי, העבר את שסתום הפלט לכיוון קו ההדחה.
   הערה: הנפח המוזרק ישתנה בהתאם למין הדגם ולאזור המוח הממוקד. קצב זרימה מהיר יותר עלול לפגוע ברקמות עצביות.
5. לאחר השלמת הניסויים, החזר את המיקרו-הזרקה בתוך צינור ההנחיה (השאר את הגשושית בולטת). ואז הסר את המיקרו-כונן לשטיפה. שטוף את המערכת המיקרופלואידית כדי להתכונן לשימוש חוזר. הערה: מניסיוננו, המיקרו-הזרקה תחזיק מעמד למספר שימושים אם ננקט טיפול נאות. איכות ההקלטה האלקטרופיזיולוגית יורדת מהר יותר מיכולת ההזרקה.

תוצאות

איור 1: ייצור צעד אחר צעד של מיקרו-הזרקה. (א) תצורה לשימוש ללא תלות במערכת מיקרופלואידית. הצינורית והגשושית נמדדים על מנת לאשר שניתן לבלוט את קצה הגשושית באורך הרצוי (למשל, 150 מיקרומטר). הגשושית נטענת מלפנים לתוך הצינורית. ה...

חומרים

https://products.labsmith.com/one-piece-fitting-plug/#.XNYFl9NKh24 מפתח משושה LabSmith 1/8 אינץ' להתקנת אביזרים ותקעים מקשה אחת (LS-HEX 1/8 אינץ' מפתח משושה) https://products.labsmith.com/ls-hex-1-8-hex-wrench/#.XO8sqtNKh24 https://www.harvardapparatus.com/standard-infuse-withdraw-pump-11-pico-plus-elite-programmable-syringe-pump.html https://www.fishersci.com/shop/products/emd-millipore-millex-sterile-syringe-filters-pes-membrane-green-4/slgpm33rshttps://products.labsmith.com/interconnect-tee#.XO8z8dNKh24

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
שסתומים ידניים עם 3 יציאות	LabSmith	Manual 3-Port Selector Valve (MV201-C360)	https://products.labsmith.com/mv201-manual-3-port-selector-valve/#.XNYEC9NKh26
Cannulae	Vita Needle Company	304 צינורות נירוסטה, קוטר חיצוני 228 מיקרומטר, קוטר פנימי 165 מיקרומטר	https://www.vitaneedle.com/assets/files/Vita_Needle_Master_Tubing_Gauge_Chart.pdf
אבן חיתוך	אבן Molex	1 אינץ' x 1 אינץ' (חלק מס' 1068680064)	מומלץ מאוד לעקוב אחר השיטה לפיצול צינורות נימיים: https://www.cmscientific.com/info_sheets/cleaving_procedure.pdf
Clorhexidine diacetate	Walmart	Nolvasan (AAP311)	משמש לשטיפת מעגלים מיקרופלואידיים, מומס ב-20 גרם/
ליטר מתאם מותאם אישית	ספק מותאם		אישית-מתאם במכונה מותאמת אישית לחיבור מיקרו-הזרקה לדרייבר מיקרו-כונן הידראולי
	LabSmith	T7 TORX להתקנת ברגי לוח לחם (LS-TORX Driver)	https://products.labsmith.com/ls-torx-driver/#.XO8sndNKh25
דבק אפוקסי	LabSmith	דבק אפוקסי בעל חוזק גבוה דו-חלקי (LS-EPOXY) להדבקת מתכת ופלסטיק	https://products.labsmith.com/ls-epoxy-12ml-epoxy-adhesive/#.XO8t89NKh24
Ferrule	LabSmith	אביזר מקשה אחת (C360-100) לחיבור נימי, דרך חור בגודל 360 מיקרומטר OD נימי	https://products.labsmith.com/one-piece-fitting#.XNYEaNNKh24
תקע פרול	LabSmith	תקע מקשה אחת (C360-101) לשימוש בכל יציאת -C360
מזרק אטום לגז	חברת המילטון	500μL מזרק אטום לגז דגם 1750 (81220) ומזרק אטום לגז 1 מ"ל דגם 1001 (81320)	https://www.hamiltoncompany.com/laboratory-products/syringes/81220#top
סיכות זהב	Aim-Cambridge	זכר מצופה זהב פין מחבר לחיצה (40-9856M)	https://www.masterelectronics.com/aim-cambridge-cinch-connectivity-solutions/409856m-10109145.html
מגבונים ללא מוך	קימברלי קלארק	Kimtech Science Kimwipes משימה עדינה	מגבונים ללא מוך, המשמשים לזיהוי נזילות במערכת
צבע	מאכל נוזלימקורמיק ושות'	צבע מאכל נוזלי שחור על בסיס מים (52100581873)<	a href='https://www.mccormick.com/spices-and-flavors/extracts-and-food-colors/food-colors/black-food-color'>https://www.mccormick.com/spices-and-flavors/extracts-and-food-colors/food-colors/black-food-color
שמן צמיגות נמוכה	Clearco Products Co.	נוזל סיליקון טהור אוקטמתילטריסילוקסן עם צמיגות של 1cSt ב-25 מעלות צלזיוס (PSF-1cSt)<	a href='http://www.clearcoproducts.com/pure-silicone-super-low-viscosity.html'>http://www.clearcoproducts.com/pure-silicone-super-low-viscosity.html
מחבר Luer-Lock	LabSmith	Luer-Lock מתאם LabSmith Luer-Lock (C360-300), אביזר נקבה לחיבור מזרק Luer Lock לצינורות נימיים של 360 מיקרומטר	https://products.labsmith.com/luer-lock-adapter-assembly#.XO81MtNKh24
מקדחי מיקרו	Grainger	מקדח מיקרו, 0.23 מ"מ (414H85)	https://www.grainger.com/category/machining/drilling-and-holemaking/drill-bits/machining-drill-bits/micro-drill-bits
מיקרואלקטרודה	FHC	מיקרואלקטרודה מתכתית, טונגסטן עם בידוד	אפוקסיhttps://www.fh-co.com/category/metal-microelectrodes
מיקרומניפולטור הידראולי שמן	Narishige Group	מיקרומניפולטור הידראולי שמן עם צינור מנחה מחובר (MO-96)	http://products.narishige-group.com/group1/MO-96/chronic/english.html
צינורות נימי פולימיקרו פולימיקרו		צינורות נימי סיליקה גמישים התמזגו (TSP150375), קוטר חיצוני 375 מיקרומטר, קוטר פנימי 150μm	https://www.molex.com/webdocs/datasheets/pdf/en-us/1068150024_CAPILLARY_TUBING.pdf
משאבת מזרק ניתנת לתכנות	משאבת אינפוזי/נסיגה סטנדרטית של מכשיר הרווארד, ניתנת לתכנות (70-2213)
Ruler	Empire	סרגל קשיח מפלדת אל חלד 6 אינץ' (27303)<	a href='http://www.empirelevel.com/rulers.php'>http://www.empirelevel.com/rulers.php
סט ברגים	סט	ברגים להרכבה של שסתומי LabSmith (LS-SCREWS .25), ברגים יוצרי חוט (2-28 x 1/4 אינץ') להרכבת שסתומים ללוח	אב-טיפוסhttps://products.labsmith.com/ls-screws-25#.XO8widNKh24
פלטפורמת LabBreadboard סטנדרטית	LabSmith	4 אינץ' x 6 אינץ' (LS600), עם מרווח חורים של 0.25 אינץ' להרכבת מעגל	נוזליםhttps://products.labsmith.com/standard-breadboard/#.XO8xDdNKh24
מי מלח סטריליים (נתרן כלורי) 0.9%.	בקסטר	0.9% נתרן כלורי סטרילי	עירוי תוך ורידי
סטרילי מסנני מזרק סטריליים	Millipore Sigma	MilliporeSigma™ Millex-GP™ מסנני מזרק סטריליים עם ממברנת PES (SLGPM33RS)
משאבת מיקרו-מזרקים ידנית Stoelting	משאבת עירוי/נסיגה ידנית של חברת Stoelting (51222)	https://www.stoeltingco.com/manual-infusion-withdrawal-pump-2649.html
צומת T	LabSmith	טי חיבור (C360-203) לשילוב זרמי זרימה, לשימוש עם צינורות נימי OD 360 מיקרומטר

חומר חיטוי תמיסתדרייבר