הדמיית דינמיקת סידן תת-תאית בתאי עצב של Caenorhabditis elegans

תקציר

מקור: Doser, R., et al. הדמיה תת-תאית של טיפול בסידן עצבי in vivo. J. Vis. Exp. (2023)

סרטון זה מדגים הדמיה in vivo של שטף סידן תת-תאי בנוירונים של חוט העצב הגחוני של זני Caenorhabditis elegans טרנסגניים. נעשה שימוש בשני מדדי סידן נפרדים: אינדיקטור ציטופלזמי בזן אחד ואינדיקטור מיטוכונדריאלי באחר. נוירונים נצפים תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לנטר שינויים בזמן אמת בעוצמת הקרינה בתוך הציטופלזמה העצבית והמיטוכונדריה, המשקפים שטף סידן במהלך פעילות עצבית ספונטנית.

פרוטוקול

1. הכנת תולעים להדמיה

1. הכנת רפידות האגר
   1. הכינו 3 מ"ל של 10% אגר על ידי המסת אגר בדרגה מולקולרית ב-M9 בצינור תרבית זכוכית בגודל 13 מ"מ x 100 מ"מ ומיקרוגל למשך מספר שניות.
      הערה. ניתן לשמור אגר מותך על גוש חום עד שעה או להכין אותו טרי בכל פעם שיש צורך ברפידות אגר.
   2. הניחו שקופית מיקרוסקופ בין שתי שקופיות נוספות שלכל אחת מהן יש שתי שכבות של סרט מעבדה (ראו איור 1A-i).
   3. חותכים את הקצה של קצה פיפטה של 1,000 מיקרוליטר (ללא מסנן) ומשתמשים בו כדי לזרוק טיפה קטנה של אגר על הכיסוי המרכזי (איור 1A-i).
   4. משטחים את האגר על ידי לחיצה על מגלשה נוספת כלפי מטה על גבי האגר (איור 1A-ii).
   5. לאחר הקירור, חותכים את האגר לדיסק קטן באמצעות פתח של צינור תרבית זכוכית בגודל 13 מ"מ על 100 מ"מ (איור 1A-iii), ולאחר מכן הסר את האגר שמסביב.
2. הכנת תמיסת גלגול התולעת
   1. ממיסים אבקת muscimol ב-M9 ליצירת מלאי של 30 מ"מ. מפרידים ל-50 מיקרוליטר ושומרים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
   2. יש להפשיר כמות חדשה של 30 מ"מ מוסקימול כל 3-5 ימים (ולאחסן בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס בזמן השימוש).
   3. מדללים מלאי שריר של 30 מ"מ ביחס של 1:1 עם חרוזי פוליסטירן כדי ליצור את תמיסת הגלגול.
3. מיקום תולעת להדמיה
   1. הנח 1.6 מיקרוליטר מתמיסת הגלגול על מרכז כרית האגר.
      הערה: יש להתאים את כמות הנוזל להדמיית בעלי חיים צעירים (פחות) או מבוגרים (יותר).
   2. באמצעות קיסם התולעים המועדף (כלומר, קיסם חוט זכוכית או פלטינה), העבירו תולעת בגיל הרצוי ללא הפנוטיפ הרב-פות לתוך תמיסת הגלגול על כרית האגר (איור 1A-iv). הערה. הנתונים המייצגים הם מהרמפרודיטים בני יום אחד (זן GCaMP6f = FJH185; זן mitoGCaMP; FJH597), שניתן לזהות על ידי נוכחות של שורה אחת בלבד של ביצים.
   3. המתן ~5 דקות עד שהמוסימול יפחית את תנועת התולעת, ולאחר מכן זרוק כיסוי בגודל 22 מ"מ על 22 מ"מ על גבי כרית האגר, והגביל פיזית את תנועת התולעת.
   4. להדמיית נויריטים בחוט העצב הגחוני, גלגלו את התולעת לכיוון שמוצג באיורים 1B ו-1C על ידי החלקה קלה של הכיסוי.
      הערה. כדי לדמיין את חוט העצב הגחוני, מקמו את התולעת עם הראש כלפי מעלה, וגלגלו את התולעת עד שהמעי נמצא בצד ימין של החלק הפרוקסימלי והשמאלי בצד החלק הדיסטלי של התולעת (מנקודת המבט של הצופה). הפוך את הכיוון הזה (איור 1C) להדמיית נויריטים בחוט העצב הגבי.
4. הרכבת התולעת על מיקרוסקופ
   1. הנח טיפה של שמן טבילה על הכיסוי לפני הרכבתו על שלב המיקרוסקופ.
   2. מצא את התולעת באמצעות אובייקט מטרה בהגדלה נמוכה (פי 10) בשדה בהיר.
   3. עבור למטרה פי 100 והתאם את המיקוד.
   4. אתר את נויריט ה-AVA באמצעות התאורה של ה-GCaMP או mitoGCaMP עם לייזר ההדמיה של 488 ננומטר.
      הערה: השתמש בהתאמות קטנות כדי למנוע ריסוק התולעת או משיכת הכיסוי.

2. רכישת זרמי תמונה ברזולוציה גבוהה

1. In vivo GCaMP imaging
   1. הגדר את זמן החשיפה ל-20 אלפיות השנייה.
   2. כוונן את הגדרות לייזר ההדמיה והרכישה עד שהפלואורסצנטיות הבסיסית GCaMP תהיה בטווח הבינוני של הטווח הדינמי של המצלמה. עיין בדיון לקבלת הצעות לאופטימיזציה של פרמטרי ההדמיה באמצעות הגדרות מיקרוסקופיה אחרות.
      הערה: עבור ההגדרה האופטית המשמשת במחקר זה, הגדר את לייזר ההדמיה של 488 ננומטר להגדרות הפלט הבאות: הספק לייזר = 50% והנחתה = 1. שנה את הגדרות הרכישה הנוספות באופן הבא: הכפלת אלקטרונים EM) רווח = 200 ורווח קדם-מגבר = 1.
   3. לאחר איתור נויריט ה-AVA באמצעות הקרינה GCaMP בהגדלה של פי 100, הגדר את מתקן סחיפה Z (ZDC, ראה טבלת חומרים) לטווח של ±30 מיקרומטר, והתחל מיקוד אוטומטי רציף. תקן ידנית את מישור המוקד לפי הצורך לפני ההדמיה.
   4. רכוש זרם של תמונות בהגדלה של פי 100. ניתן להשיג משכי זמן ארוכים של עד 10 דקות עם ההגדרה ששימשה במחקר זה.
2. in vivo mitoGCaMP imaging
   1. בצע את השלבים 2.1.1- 2.1.2 לפי הצורך כדי לרכוש את הקרינה הבסיסית mitoGCaMP בטווח הבינוני עבור הטווח הדינמי של המצלמה.
      הערה. עבור ההגדרה האופטית המשמשת במחקר זה, הגדר את לייזר ההדמיה של 488 ננומטר להגדרות הפלט הבאות: הספק לייזר = 20% והנחתה = 10. שנה את הגדרות הרכישה לדברים הבאים: רווח EM = 100 וקדם-ampרווח = 2.
   2. לאחר איתור המיטוכונדריה בנויריט AVA באמצעות הקרינה mitoGCaMP, הגדר את ה-ZDC כמתואר לעיל בשלב 2.3.
   3. רכוש זרם של תמונות בהגדלה של פי 100.

תוצאות

איור 1: הרכבה וגלגול של C. elegans להדמיית חוט העצב הגחוני. (א) איור של השלבים להכנת רפידות האגר ואיסוף תולעת בודדת לתמיסת גלגול. (B) דוגמה למיקום תולעת לפני מיקומה מ...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
100x/1.40 Oil objective	Olympus		UPlanSApo
10x/0.40 Objective	Olympus		UPlanSApo
22 מ"מ x 22 מ"מ זכוכית כיסוי	VWR	48366-227
Agarose SFR	VWR	J234-100G
שולחן מעבדה CleanBench	TMC		עם בקרת רטט
גלגל מסנן או מחוון	ASI		עבור מסננים בקוטר 25 מ"מ
FJH 185	מרכז גנטיקה Caenorhabditis	FJH 185	זן תולעת
FJH 597	מרכז גנטיקה Caenorhabditis	FJH 597	זן תולעת
GFP מסנן פליטת פס פס Chroma			525 ± 50 ננומטר (קוטר 25 מ"מ)
ILE משלב לייזר	Andor Technologies		4 קווי לייזר
ILE מצב מוצק 488 ננומטר לייזר	Andor Technologies		50 mW
IX83 דיסק מסתובב מיקרוסקופ קונפוקלי	אולימפוס		עם Yokogawa CSU-X1 מסתובב דיסק
iXon Ultra EMCCD מצלמה	אנדור טכנולוגיות
שמן טבילה פלואורסצנטי אוטומטי נמוך	אולימפוס	Z-81226
MetaMorph	מכשירים		גרסה 7.10.1
תיבת בקרת מיקרוסקופ	אולימפוס		IX3-CBH
Muscimol	MP ביו-רפואי / סיגמא	02195336-CF
מיקרוספירות פוליחרוזים	פוליסיינסס בע"מ	00876-15	0.094 מיקרומטר
תא יציבות	Norlake Scientific	NSRI241WSW/8H	מוגדר ל-15 °C
בקר במה	ASI		עם בקרת גלגל מסנן
שקופית מיקרוסקופ סטנדרטית	בכורה	9108W-E	75 מ"מ x 25 מ"מ x 1 מ"מ
בקר לוח מגע	Olympus		I3-TPC
Z-drift מתקן סחיפה	אולימפוס		IX3-ZDC2

מולקולריים