כימות קוצים דנדריטיים באמצעות הדמיה מיקרוסקופית קונפוקלית

תקציר

מקור: Gouder, et. al. כימות תלת מימדי של קוצים דנדריטיים מנוירונים פירמידליים שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם. J. Vis. Exp. (2015).

סרטון זה מדגים את ההדמיה והניתוח של קוצים דנדריטיים בתאי עצב פירמידליים עם תווית חיסונית באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית. רעשי הרקע מצטמצמים, והדנדריטים עוקבים על ידי הערכת קוטרם ואורכם. פילוח עמוד שדרה אוטומטי כולל קביעת פרמטרים למידות דנדריט ועמוד שדרה וסיווג עמודי שדרה. מודל תלת מימד נוצר ומיוצא לניתוח.

פרוטוקול

1. תרבית עצבית

1. טפל בצלחות תרבית של 6 בארות עם כיסויי זכוכית עם פולי-אורניתין (מדולל ל-1/6 במי מלח פוספט-חוצץ (DPBS) של Dulbecco, ריכוז מלאי 0.01%) למשך הלילה (O/N), ואחריו שלוש שטיפות ב-DPBS. לאחר מכן, הוסף למינין (ריכוז מלאי 1 מ"ג/מ"ל, מדולל 500 פעמים ב-DPBS) למשך 10 שעות לפחות מתחת למכסה המנוע.
2. צלחת ושלח תאי גזע עצביים (NSC) בצפיפות נמוכה (50,000 תאים/סמ"ר) בצלחות תרבית של 6 בארות עם כיסויי זכוכית ב-3 מ"ל של מדיום תרבית המורכב מתערובת מדיום הנשר/תזונה F-12 או DMEM/F12 של Dulbecco (500 מ"ל), 2 בקבוקונים (5 מ"ל כל אחד) של תוסף N2, 2 בקבוקונים (10 מ"ל כל אחד) של תוסף B27, 10 מ"ל של Pen-Streptomycin (פניצילין = 10,000 יחידות למ"ל וסטרפטומיצין = 10,000 יחידות למ"ל), 1 מ"ל של 2-מרקפטואתנול (תמיסת מלאי: 50 מ"מ) ולמינין (1/500), ללא גורמי גדילה.
   שלב קריטי: בצע שלב זה בזהירות על ידי הוספת תאים עם תנועות סיבוב איטיות כדי להפחית את התקבצות התאים.
3. הסר את מדיום התרבות. הוסף מדיום N2B27 טרי המכיל 2 מיקרוגרם/מ"ל של תמיסת למינין טרייה כדי לשמור על הנוירון מחובר לכיסויי הזכוכית ולמנוע גושים. החלף את המדיום כל 3 ימים. שמור חלק מהמדיום הנותר (200 מיקרוליטר) לפני הוספת מדיום טרי על מנת למנוע התייבשות של התא. לחלופין, המשך במהירות ושנה את הנפח הכולל (3 מ"ל).

2. הערת התמרה לנטיויראלית

: ביטוי חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) מונע על ידי מקדם הפוספוגליצרט קינאז (PGK) של העכבר. במחקר זה, הטיטר הנגיפי היה 400 ננוגרם/מיקרוליטר (תמיסת מלאי בתמיסת מלח עם פוספט (PBS) 1x).

1. להמיר תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי אדם או נוירונים שמקורם ב-iPSC בכל שלב של התבגרות על ידי חלקיקים נגיפיים על ידי הוספת 1 מיקרוליטר של תמיסת המלאי המכילה 40 ננוגרם של וקטור לנטי-ויראלי GFP לכל באר תרבית (צלחות 6 בארות) ודגירה למשך 48 שעות במדיום תרבית טרי. הערה: עבור פרוטוקול זה, משך הדגירה מאפשר תיוג טוב של מבני עמוד השדרה.

3. הערה אימונופלואורסצנטית

: על מנת לשפר את התיוג של כל המורפולוגיה של עמוד השדרה, בוצע תיוג אימונופלואורסצנטי באמצעות נוגדן נגד GFP בתנאים חדירים .

1. הסר את מדיום התרבות וקבע תאים מותמרים על תלושי כיסוי ב-4% פרפורמלדהיד למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר או RT, ולאחר מכן שטוף 3 פעמים ב-1x PBS (10 דקות כל אחד).
2. טבלו את הכיסויים ב-PBS בתוספת 0.05% טריטון (100x) ו-10% סרום סוס למשך שעה אחת ב-RT, ולאחר מכן שטפו 3 פעמים ב-1x PBS.
3. הוסף 100 מיקרוליטר של 1x PBS בתוספת 4% סרום סוס ונוגדנים ראשוניים (1/1,000) שהועלתה כנגד GFP ומדוללת בפקטור של 1,000 על כל כיסוי. דגרו בקופסה חשוכה O/N ב-4 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן שטפו 3 פעמים עם 1x PBS.
4. לדלל את הנוגדן המצומד Alexa Fluor 488 (1/200) ב-PBS בתוספת 0.5% Tween 20 ולדגור למשך שעה אחת ב-RT. לאחר מכן, שטפו 3 פעמים ב-PBS 1x והרכיבו כיסויים על שקופיות זכוכית עם מדיום הרכבה למיקרוסקופיה פלואורסצנטית.

4. הדמיית עמוד שדרה דנדריטי

1. בצע הדמיה קונפוקלית באמצעות מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי.
2. בחר נוירונים בריאים עם מורפולוגיה פירמידלית וארבוריזציה דנדריטית מלאה, וכמת לפחות 10 נוירונים לכל מצב מניסויים נפרדים. כמת 60 - 100 מיקרומטר לדנדריט.
3. רכוש תמונות באמצעות אובייקט שמן 40X NA = 1.3 וקו לייזר 488 ננומטר לעירור GFP, עם הספק שיא טיפוסי ברמת הדגימה סביב 20 μW. הגדר את גודל הפיקסלים סביב 80 ננומטר כדי לדגום כראוי קוצים דנדריטיים.
   הערה: הניתוח הבא דורש תמונה שבה הרעש אינו פוגע בפילוח הנכון של דנדריטים וקוצים. עם הדגימה המרחבית והגדרות ההספק שהוזכרו לעיל, ראינו שזמן שהייה של פיקסלים של 3.15 מיקרון מספיק כדי לאסוף מספיק פוטונים כדי לבנות תמונה כזו. עבור דגימות עמומות, ניתן לשפר את איכות התמונה על ידי ממוצע של 2 עד 4 סריקות. ייתכן שיהיה צורך ברכישה של מספר אריחי XY כדי לכסות את אזור העניין, אשר לאחר מכן יש לתפור יחד לפני העיבוד.
4. כדי לדגום את כל נפח הנוירונים, רכוש מחסנית Z עם מרווח Z שנע בין 150 ננומטר ל-300 ננומטר, ומניב 20 עד 30 פרוסות Z.
   הערה: הרזולוציה המרחבית הרוחבית המושגת עם הגדרות אלה היא 234 ננומטר, והרזולוציה הצירית היא 591 ננומטר. הדגימה שנבחרה כאן מספקת, אך מכיוון שהרזולוציה הצירית גדולה מהגודל הקטן ביותר של הקוצים שיש לצלם, הניתוח מעדיף את הקוצים המשתרעים לרוחב מהדנדריטים.

5. 3D כימות של קוצים דנדריטיים

הערה: הסעיפים הבאים מתארים באופן ספציפי את השימוש בתוכנת אימאריס לניתוח. קיימים יישומים חלופיים, כולל NeuronStudio או Metamorph, שיכולים לספק תוצאות דומות.

השתמש בהגדרות המפתח הבאות:

1. כשלב עיבוד מקדים, נעשה שימוש בסינון גאוס באמצעות מתקני עיבוד התמונה המוצעים על ידי התוכנה. בצע סינון גאוס באמצעות עיבוד תמונה > החלקה > מסנן גאוס. הגדר את רוחב המסנן כך שיהיה שווה לגודל הפיקסלים ב- XY.
2. בצע מעקב חצי אוטומטי אחר דנדריטים באמצעות מודול ה-Filament Tracer של התוכנה.
   1. ראשית, הערך את קוטר הדנדריטים באמצעות כלי המרחק בכרטיסייה פרוסה של התוכנה.
   2. בכרטיסייה Surpass, לחץ על הכלי Filaments. לחוסן טוב יותר, פרוטוקול זה מסתמך על מעקב אוטומטי למחצה; לחץ על דלג על יצירה אוטומטית. ממשק המודול מציג כעת את הכרטיסייה ציור. כאן, בחר נתיב אוטומטי כשיטה, דנדריט כסוג והזן את קוטר הדנדריט המשוער.
   3. השתמש במצב בחירה של המצביע והפוך את הסמן לתיבה. הקישו Shift ולחצו לחיצה ימנית על נקודת ההתחלה של הדנדריטים. הערה: התוכנה מבצעת חישובים ראשוניים.
   4. הזז את המצביע לאורך הדנדריט. מנקודת ההתחלה (המיוצגת ככדור כחול), מוצג קו צהוב המייצג את נתיב הדנדריטים הסביר ביותר. הקישו Shift ולחצו לחיצה שמאלית על נקודת הקצה של הדנדריט.
3. בצע את פילוח הקוצים האוטומטי. הערה: יש למצוא את הקוצים על הדנדריט המסומן באופן אוטומטי על ידי ממשק המודול.
   1. בממשק המודול, לחץ על הכרטיסייה יצירה. ברשימה הנפתחת בנה מחדש, בחר בנה מחדש את קוטר הדנדריט וסמן את התיבה שמור נתונים. לאחר מכן לחצו על 'בנייה מחדש'.
   2. הגדר את הסף כך שהנפח המפולח יתאים לנפח הדנדריטים בפועל. כאלגוריתם, בחר את המרחק הקצר ביותר ממפת המרחק. לחץ על לחצן הבא.
   3. קבע את קוטר ראש עמוד השדרה הקטן ביותר ואת האורך המקסימלי, שוב באמצעות כלי המרחק בכרטיסייה פרוסה של התוכנה, ולאחר מכן חזור לכרטיסייה מעבר והזן את הפרמטרים. עבור פרוטוקול זה, ערכים בסביבות 200 - 300 ננומטר עבור קוטר מינימלי ו- 4 מיקרומטר עבור אורך מקסימלי הם נקודות התחלה טובות. אל תסמן את התיבה אפשר קוצים של ענפים. לחץ על לחצן הבא.
   4. התאימו את סף נקודות הזרע כך שהנקודות הכחולות המייצגות את עמודי השדרה יתמקמו בראשי השידרה בפועל. לחץ על לחצן הבא. הערה: חישוב הליבה נעשה כעת ויכול להיות ארוך.
4. סווג קוצים על ידי מעבר לכרטיסייה כלים בממשק המודול. לחץ על סיווג עמודי שדרה. בממשק המשתמש המתבקש, ודא שישנן ארבע מחלקות, המוגדרות על ידי המורפולוגיה שלהן באופן הבא: Stubby: אורך <1 מיקרומטר; פטרייה: אורך (עמוד שדרה) >3 ורוחב מקסימלי (ראש) >רוחב ממוצע (צוואר) x 2; ארוך דק: רוחב ממוצע (ראש) ≥ רוחב ממוצע (צוואר); דמוי פילופודיה: אורך ≤ 4 מיקרומטר (ללא ראש). הערה: ממשק המודול מייצר ארבעה אובייקטי נימה חדשים המכילים את תוצאות הסיווג.
5. ייצוא נתונים סטטיסטיים: בכל אחד מארבעת ממשקי האובייקטים הללו, עבור ללשונית סטטיסטיקה. לחץ על הלחצן ייצוא כל הנתונים הסטטיסטיים לקובץ.
   הערה: ניתן לייצא ערכים סטטיסטיים אחרים עבור דנדריטים (למשל, אורך, שטח, קוטר ממוצע, עומק ענף, זווית הסתעפות, נפח וכו') ועמודי שדרה (למשל, ישרות, שטח חיבור, אורך ונפח של חלקי עמוד שדרה מובחנים, קוטר עמוד השדרה, צפיפויות וכו').

חומרים