Method Article

הכנת Synaptoneurosomes מ - עכבר Cortex באמצעות צבע רציפה Percoll-סוכרוז צפיפות

DOI:

10.3791/3196

⸱

September 17th, 2011

 ,  ,  , 
1Department of Pathology and Laboratory Medicine, Waisman Center for Developmental Disabilities, University of Wisconsin, 2Department of Biochemistry, Waisman Center for Developmental Disabilities, University of Wisconsin

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שיטה להכין פעיל translationally, synaptoneurosomes שלם (SNS) של קליפת המוח עכבר מתואר. השיטה משתמשת שיפוע רציפה Percoll-סוכרוז צפיפות המאפשרת הכנה מהירה של פעיל SNS.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Synaptoneurosomes (SNS) מתקבלים לאחר homogenization ועל חלוקה של קליפת המוח העכבר. הם resealed שלפוחית ​​או מסופי מבודדים להתנתק מסופי האקסון כאשר רקמת קליפת המוח הוא הומוגני. SNS לשמור על המאפיינים טרום postsynaptic, מה שהופך אותם שימושיים בחקר בשידור סינפטי. הם שומרים על מנגנון מולקולרי המשמש איתות עצבי ומסוגלים ספיגת, אחסון, שחרור של נוירוטרנסמיטורים.

ההפקה והבידוד של פעיל SNS יכול להיות בעייתי כמו שימוש במדיות Ficoll, אשר ניתן ציטוטוקסיות ודורשים צנטריפוגה המורחבת עקב צפיפות גבוהה, סינון ושיטות צנטריפוגה, אשר עלולה לגרום פעילות נמוכה עקב נזק מכני של SNS. עם זאת, השימוש Percoll-סוכרוז הדרגתיים רציפה צפיפות לבודד SNS מספק שיטה מהירה כדי לייצר תשואות טובות של SNS פעיל translationally. השיטה Percoll-סוכרוז שיפוע הוא מהיר ועדין כפי שהיא מעסיקה התנאים איזוטוני, יש ספינים צנטריפוגה פחות קצר נמנע צעדים צנטריפוגה כי גלולה SNS ולגרום נזק מכני.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. ההכנות 1-4

  1. הכן 500 מ"ל חיץ של שיפוע בינוני (GM) על ידי ערבוב 50 מ"ל של slurry M 2.5 סוכרוז, 2.5 מ"ל של 1M טריס-HCl, pH7.5 המניות, 0.1 מ"ל של 0.5 מ 'EDTA, pH 8.0 מניות עם מילי ש מים בנפח. סנן לעקר את הפתרון, aliquot ולאחסן קפוא.
  2. הכינו מלאי של tetrodotoxin 1000x (TTX) על ידי ביצוע פתרון 1 מ"מ מילי Q-H 2 O. Aliquots של TTX ניתן לאחסן ב -20 ° C.
  3. הכנת מאגר גירוי 10x ידי ביצוע פתרון של 100 מ"מ טריס (pH 7.5), 5 mM Na 2 HPO 4, 4 מ"מ KH 2 PO 4, 40 mM NaHCO 3, 800 mM NaCl במים אלפית-Q. במלאי ניתן לאחסן 4 ° C.
  4. טרום מגניב צנטריפוגות עד 4 ° C.
  5. הכן פתרון המניות של Percoll Isosmotic (SIP) על ידי הוספת 9 כרכים של Percoll (18 מ"ל) עד ​​נפח של 1 סוכרוז 2.5 M (2 מ"ל) מים אלפית-Q ומערבבים היטב.
  6. הכן את 3, 10, 15, שכבות צבע 23% על ידי הוספת כמויות בהתאמה של SIP ל GM חיץ ערבוב כל:

טבלת סדרת שיפוע; נתוני פתרון חיץ; ריכוז לעומת אחוז שיפוע; מחקר.

  1. יוצקים שכבות צבע על ידי pipetting 2 מ"ל כל אחד 23, 15, 10, ו -3% פתרונות Percoll isosmotic לתוך צינורות צנטריפוגה Beckman עם כמוסות באמצעות P1000 Gilson Pipetman. ממשק בין השכבות יש להבחין בבירור ללא ערבוב של שכבות. חנות הדרגתיים על 4 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות לפחות לפני השימוש. מילויים ניתן לאחסן עד 24 שעות למרות השימוש באותו היום מומלץ. [אנשי המעבדה מנוסים יכולים להתאמן הדרגתיים הכנת ידי הוספת צבע כחול הפתרונות isomotic Percoll להדמיה של ממשקים השכבה.]

2. עכבר לנתיחה 1

  1. ודא שכל בעלי העכבר המתת חסד נהלים מבוצעות בהתאם להנחיות NIH ואוניברסיטת. להרדים גורים (גיל P13 ל p21) בחנק פחמן דו חמצני או בשיטה אושרה בפרוטוקול של בעלי חיים.
  2. הצמד את העכבר ללוח לנתיחה ולרסס את החלק האחורי של הצוואר והראש עם אתנול. בעזרת מספריים חדות לחתוך חוט השדרה בבסיס הגולגולת, להסיר את העור מהחלק העליון של הגולגולת, לחתוך את הגולגולת רוחבית בין העצם הקודקודית ואת עצם interparietal או בין המוח לבין אזורים בקליפת המוח. ואז לחתוך את הגולגולת מהבסיס אל האף (יחד תפר sagital), להסיר בזהירות את העצם הקודקודית רכים על ידי משיכת כל חצי הכדור בצד ולהסיר את הקליפה עם מרית. הכנס את מרית לתוך המוח מעל במוח הקטן ואז לגרוף את קליפת ולמקם אותו חיץ GM קר כקרח. המשך מיד לשלב homogenization. אל תתנו הקורטקס יושבים חיץ קר כקרח לאורך זמן כמו זה ישפיע לרעה על היווצרות של SNS.

3. הכנת homogenate ו SNS 1-4

  1. יש לשטוף את קליפת המוח ב קר כקרח חיץ GM ולהעביר two הקורטקס ל Dounce זכוכית homogenizer המכיל 5 מ"ל של חיץ GM קר.
  2. הומוגני בעדינות הקורטקס במשיכות 5-10 של העלי רופף (העלי "A"), ואחריו שבץ 5-10 של העלי צמודים (העלי "B"). הסטרוקס צריך להיות מהיר, אבל איטי מספיק כדי לא לגרום בועות אוויר. תמונה של homogenate לאחר homogenization הוא Scheme 1. מספר משיכות ישתנו תלוי homogenizer הפרט pestles הנלווים. בסיום הדרגתיים צריך לתת להקה חזקה SN, אם לא, להתאים את מספר משיכות.
  3. מעבירים את homogenate ל 15 מ"ל חרוטי ו צנטריפוגות ב 1000xg במשך 10 דקות על 4 מעלות צלזיוס הרוטור דלי מתנדנד (אלגרה 6KR צנטריפוגות) כדי פסולת הסלולר גלולה גרעינים. תמונה של homogenate סובב הוא Scheme 1.
  4. שכבה 2 מ"ל של supernatant לכל כובע Percoll-סוכרוז שיפוע, צינורות, ו צנטריפוגות ב XG 32,500 עבור 5 דקות על 4 מעלות צלזיוס הרוטור קבוע זווית (Beckman J2-21 צנטריפוגות, JA-17 הרוטור) באמצעות מתאמים המתאים ( ראה ריאגנטים ולוח ציוד).
  5. פיפטה וישאירו את הפתרון הנ"ל הלהקה SN בעזרת פיפטה פסטר זכוכית. פיפטה את הלהקה SN בממשק% 15/23, להעביר ולאחסן חרוט על הקרח. כל צבע או קליפת תייצר 0.9-1.1 מ"ל של SN.
  6. התאם את ריכוז מלח של SNS ידי הוספת עשירית נפח המאגר גירוי 10x, להוסיף CaCl 2 1000x לריכוז סופי של 12 ננומטר, ולהוסיף 1 מניות TTX מ"מ עד ריכוז סופי של 1 מיקרומטר לדכא עירור ספציפי. (תוספת של CaCl 2 הוא אופציונלי אם זה יפריע יישומים במורד SN).
  7. קביעת ריכוז חלבון של SNS באמצעות BCA Assay מיקרו ערכת חלבון. (Assay חלבון ברדפורד אינה מומלצת בגלל היקש מן Percoll).
  8. SNS ניתן להשתמש ישירות ובמהירות לחלבון translaמחקרים tion. עבור יישומים אחרים SN lysate ניתן לנקות או מרוכז באמצעות SDS-PAGE פירס ערכת הכנה המדגם.

4. נציג התוצאות:

כאשר סמן העכבר קליפת היה הומוגני ומופרד על Percoll-סוכרוז הדרגתיים רציפה (תוכנית 1), 6 להקות או שברים נראו (איור 1). היא הוצגה בעבר עבור עכברוש בקליפת המוח 3,5 כי המרכיבים של להקות משקל מולקולרי גבוה נשברו הממברנה המיאלין, וכי החומר הכלול pelleted המיטוכונדריה או אברונים (טבלה 1). 23% / 15% ממשק (Band 5) הכילו את SNS מועשר.

הלהקה על ממשק / 23% 15%, המכיל SNS שלם, הוסר נבדק על ידי מיקרוסקופ אלקטרונים (EM) כפי שתואר קודם לכן. EM 2,6 הראו נוכחות של שלפוחית ​​סינפטית שלם שימור אלמנטים presynaptic ו postsynaptic (איור 2). בידוד של תאים טרום postsynaptic חשוב לבחינת איתות סינתזת החלבון, אשר מתרחשת בתאים שניהם. 7-13 שיפוע Percoll-סוכרוז הוא טיהור גולמי כך ראינו קטין זיהום הסלולר, גרעיני אברון בשבריר SN אבל ההפרדה הכללית היתה טובה.

כאשר נבדק על ידי כתם המערבי, שברים Percoll הכיל את סמנים חלבון צפוי עם עלייה טוהר הסינפטי בלהקה SN (איור 3, לוח 2). סמנים Synaptic ואת עצבי נשמרו בלהקה מועשר SN (Band 5), אך שפע של סמנים אחרים צומצם משמעותית. בפרט, את נוכחותו של GFAP, סמן תאים astrocyte ו neoplastic ממוצא גליה, lamin ו-B1, סמן גרעיני, היו זניחות, תוך סמנים מבניים הסינפטי נשמרו או משופרת. בנוסף, היתה השמירה של סמנים עבור האברונים, כדוגמת מיטוכונדריה Golgi, אשר ממלאים תפקיד סינתזת החלבון.

התשואות אופיינית ללהקה SN היו 250-500 ננוגרם חלבון לכל μL, כפי שנקבע על ידי assay חלבון BCA. הפעילות של SNS נקבע על ידי כמות חלבון סינתזה דה נובו הנוכחי בפיקוח על ידי [35S]-Met ההתאגדות (איור 4). 2 פעילות בסל translational היה גדל פי 1.56, כאשר SNS היו מגורה עם מיקרומטר 50 מיקרומטר glutamate/10 גליצין (Glu) או 5.12 להתקפל כאשר מופעלים עם juglone מעכבי Pin1. עיכוב Pin1 ידוע לגרום סינתזת חלבון מוגברת. 2 כדי לאשר את הגידול [35S]-Met ההתאגדות נבע סינתזת חלבון דה נובו, הוספנו 40 anisomycin מיקרומטר, מעכב את סינתזת החלבון, וראיתי ירידה ניכרת ההתאגדות בנוכחות והיעדר Glu לעומת רמות הבסיס. על כן, עם תוספת של 2% טריטון X-100, אשר משבש את היושרה של SNS, התרגום היה הבסיס ירדו ב 75%. 2 כמו כן, כאשר בוחנים את הלהקות (B4-B6) שהראו את ההעשרה סמן הסינפטי ביותר, SNS או Band 5 היתה הפעילות הגדולה ביותר עבור סינתזה דה נובו חלבון (איור 5). לפיכך, רציפה Percoll-סוכרוז הדרגתיים לייצר במהירות פעיל מאוד מועשר הלהקה SN כי ניתן להשתמש כדי ללמוד תרגום חלבון.

ההליך רציפה Percoll-סוכרוז שיפוע יתרון יותר מאשר שיטות אחרות בגלל נזק מכני נגרמת על ידי תנאים קשים. כאשר לעומת שיטת סינון, שבו פינו homogenate קליפת המוח עובר דרך סדרה של מסננים ירידה בגודל, 3,14-15 השיטה Percoll צורות SNS יותר עם ​​פעילות גדולה יותר. כפי שניתן לראות באיור 6, כאשר aliquot של SNS שהוכן על ידי שיטת סינון עברה מעל שיפוע Percoll-סוכרוז יש SNS הרבה פחות על הממשק% 15/23 ו - כמות גדולה יותר של הקרומים שבור. כאשר דה נובו סינתזת החלבון נמדדה באמצעות שילוב-S35 נפגשו, SNS שהכין בשיטת הסינון היו הרבה פחות פעילים (איור 7). כדי למקסם את פעילות translational אנו משתמשים בעכברים, כי הם בין גיל P14 ו - p18. SN ניתן להכין מעכברים מבוגר, אבל צפינו בפעילות translational גדל באופן משמעותי עם SN מוכן מעכברים נעורים (איור 8).

דיאגרמת טבלת רכיבים סלולריים המפרטת את הממברנה, המיאלין, SNs והתפלגות האברונים.
טבלה 1. המרכיבים של להקות מן Percoll-שיפוע fractionations רציפה של קליפת עכבר הומוגני. 3,5

טבלת ביטוי סמני חלבון; ניתוח השוואתי של להקות עם סמנים למבנים תאיים.
טבלה 2. סיכום של ניתוח הבריח המערבי רציפה Percoll-סוכרוז המרכיבים להקה הדרגתי. ריכוזי חלבון יחסית עבור כל אחד שברים הלהקה מבודדים באמצעות Percol רציפהl-סוכרוז שיפוע נקבעו על ידי כתם המערבי. אין להציג חלבון (-), 0 ≥ 0.2 (+), 0.2 ≥ 0.8 (++), או> 0.8 (+++) לקפל יותר מאשר בהווה חלבון נציג supernatant (S, centrifuged קליפת homogenate) של n = 3.

דיסקציה של קליפת המוח, הומוגניזציה במאגר, צנטריפוגה של שיפוע, תהליך בידוד פס SN.
תוכנית 1: סכמטי של הכנה SN באמצעות שיפוע רציפה Percoll-סוכרוז צפיפות בקורטקס המוח עכבר נותחו, הומוגני, ו centrifuged במהירות נמוכה כדי להסיר אי - הומוגני רקמות, תאים, אברונים שלמים כגון גרעינים וממברנות.. שיפוע רציפה צריך מוגדרים בבירור שכבות. התמונה הבלעה מציג דוגמה של שכבות, אשר היה צבוע כחול לצורכי המחשה בלבד כדי להמחיש את השכבות. Supernatant היא על גבי שכבות של צבע Percoll-סוכרוז רציפה ו centrifuged במהירות בינונית. הלהקה SN מאוחזר אז מן השיפוע והוא מוכן לשימוש.

צנטריפוגת שיפוע בצפיפות שיווי משקל, תרשים עם רצועות שיפוע לניתוח הפרדת חלבונים
באיור 1. חלוקה Homogenate על שיפוע Percoll-סוכרוז רציפה. עכבר קליפת היה הומוגני ומופרד על שיפוע Percoll-סוכרוז רציפה והוליד 6 להקות או שברים. , מטוהרים פעיל SNS (*) נמצאו בנד 5.

תמונת מיקרוסקופ אלקטרונים שידור, אברונים סלולריים עם חיצים אדומים, ניתוח מבנה התא.
איור 2. ההכנות SN לתת תערובת הטרוגנית של SNS כי לשמר אלמנטים presynaptic ו postsynaptic. מיקרוסקופ אלקטרונים של הכנה SN שהוכן C57BL / 6 עכברים (גיל P13 ל p21) בוצעה SNS כפי שתואר לעיל מראה עם אלמנטים presynaptic ו postsynaptic נשמר 2. , 6 נקודת חצים אדומים להודעה הסינפטי צפיפויות. בר סולם הוא 1 מיקרומטר.

תוצאות כתם מערבי המראות ביטוי חלבון של β-אקטין, GFAP, SNAP25; רצועות 1-6, S.
איור 3. מנתח כתם המערבי של ההכנות SN הראו כי סמנים הסינפטי ו העצבית נשמרו ב SNS מטוהרים (Band 5), אך שפע של סמנים אחרים צומצם משמעותית. Immunoblots של supernatant (S, centrifuged homogenate קליפת המוח) ו 1-6 להקות של רציפה Percoll-סוכרוז שיפוע נבדקו עבור β-אקטין (שליטה מבניים, העמסה), GFAP (astrocytic), GP73 (Golgi), HSC70 (cytoplasmic גרעינית), lamin-B1 (גרעינית), Prohibitin (המיטוכונדריה), PSD95 (צפיפות postsynaptic ), SNAP25 (הסינפטי), Synaptophysin (הסינפטי) ו-β3 טובולין (נוירון ספציפי). הלהקות היו דמיינו באמצעות Phosphorimager 860 סטורם, נציג של n = 3.

אלקטרופורזה של חלבונים וטבלת שילוב S35-Met; ניתוח של השפעות גלו, אניסו.
איור 4. SNS פעילים ולהציג דה נובו סינתזת החלבון באמצעות [35S]-Met ההתאגדות. SNS היו מראש equilibrated על 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. ואז SNS היו מטופלים או pretreated במשך 15 דקות עם anisomycin 40 מיקרומטר או 1 מיקרומטר juglone ב 37 ° C ואחריו תוספת של [35S]-Met, 20 μl לייבל Pro Express Mix S35 תג קל, פלוס מינוס Glu ב 37 ° C למשך 30 דקות. הדגימות נערכו באמצעות SDS-PAGE פירס ערכת הכנה המדגם, לרוץ על ג'ל polyacrylamide 15%, מיובשים ונרשמת באמצעות דינמיקה מולקולרית 860 סטורם phosphorimager, נציג של n = 3, ± SEM.

אלקטרופורזה של ג'ל וגרף עמודות המשווה רמות שילוב חלבונים; מציג נתוני S35-Met.
איור 5. Band 5 מתוך השיפוע Percoll-סוכרוז רציפה הכיל את הרמות הגבוהות ביותר של סינתזת חלבון דה נובו. להקות 4, 5 ו 6 ואת supernatant (S, centrifuged homogenate קליפת המוח) היו מראש equilibrated על 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. אז, [35S]-Met, Express Mix Pro לייבל S35 תג קל, נוספה, פלוס מינוס Glu ב 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. הדגימות נערכו באמצעות SDS-PAGE פירס ערכת הכנה המדגם, לרוץ על ג'ל polyacrylamide 15%, מיובשים ונרשמת באמצעות דינמיקה מולקולרית 860 סטורם phosphorimager, נציג של n = 3, ± SEM.

טיהור חלבונים, צינורות היווצרות משקעים, השוואת תוצאות ניסוי.
איור 6. SNS שהוכן שיטת סינון מכילים ממברנות נשבר יותר SNS שלם פחות SNS שהוכן בשיטת Percoll-סוכרוז רציפה הדרגתי. SNS הוכנו על ידי העברת קליפת הומוגני דרך סדרה של מסננים עם הפחתת גודל הנקבוביות כפי שתואר לעיל. 3,14-15 aliquot של SNS שהוכן על ידי שיטת הסינון היתה centrifuged מעל מפל Percoll-סוכרוז רציפה ולעומת בסכום שווה ערך החומר בשיטה רציפה Percoll-סוכרוז הדרגתי.

ג'ל SDS-PAGE ותרשים עמודות של התאגדות S35-Met; ניתוח חלבון, תוצאות ניסוי.
איור 7. SNS שהוכן שיטת סינון מכילים פחות דה נובו סינתזת חלבון פעילות מאשר SNS מוכן הלוך ושובמ 'שיטת רציפה Percoll-סוכרוז הדרגתי. SNS הוכנו על ידי העברת קליפת הומוגני דרך סדרה של מסננים עם הפחתת גודל הנקבוביות כפי שתואר לעיל, 3,14-15 ועל ידי Percoll-סוכרוז שיטות רציפה הדרגתי. SNS מן ההכנות הן היו מראש equilibrated על 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. אז, [35S]-Met, Express Mix Pro לייבל S35 תג קל, נוספה, פלוס מינוס Glu ב 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. הדגימות נערכו באמצעות SDS-PAGE פירס ערכת הכנה המדגם, לרוץ על ג'ל polyacrylamide 15%, מיובשים ונרשמת באמצעות דינמיקה מולקולרית 860 סטורם phosphorimager, נציג של n = 3, ± SEM.

ג'ל SDS-PAGE וגרף עמודות המציג שילוב S35-Met בדגימות חלבון בתנאי בקרה וגלוקוז.
איור 8. SNS מעכברים צעירים יותר (P14) יש פעילות translational יותר מאשר עכברים מבוגרים (P85). SNS הוכנו מעכברים בגילאים שונים בשיטת רציפה Percoll-סוכרוז שיפוע, preequilibrated על 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, טיפול או מטופל עם Glu ב נוכחות [35S]-Met (לייבל Pro Express Mix S35 תג קל) למשך 30 דקות, הצמד קפוא, וניקה מאוחר יותר את ערכת SDS-PAGE הכנה פירס לדוגמה. SNS נוהלו אז על ג'ל SDS-polyacrylamide 12%, מיובשים הדמיה על דינמיקה מולקולרית 860 נציג סטורם, phosphorimager של n = 3, ± SEM. SNS מ P14 העכברים היו לפחות פי 3 יותר פעיל P85 עכברים.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הכנה רציפה Percoll-סוכרוז שיפוע המתוארים כאן היא שיטה מהירה, אמינה לבודד SNS פעיל, אשר ניתן להשתמש במגוון של ניסויים בשידור סינפטי. שיטה זו שיפוע, אשר מבוססת על שיטה שפותחה על ידי Dunkley et al. 3,4 הוא המוח subcellular חלוקה הליך המבודדת הן טרום postsynaptic קרום הנגזרות שלפוחית ​​הקשורים זה לזה. ללא טיהור נוסף SNS אלה עולים בקנה אחד עם מגוון רחב של טכניקות הביולוגיה המולקולרית, כולל immunoprecipitation, המערבי סופג, cytometry זרימה, ניטור דה נובו סינתזת החלבו...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ברצוננו להודות BK אוגוסט מאוניברסיטת מתקן אלקטרונים וויסקונסין מיקרוסקופ עבור במיקרוסקופ אלקטרונים. עבודה זו נתמכה על ידי NIH מענקים R01-DA026067 ו-P30 HD03352 (עד JSM).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
שם מגיב חברה מספר קטלוגי הערות (אופציונלי)
מיקרו Assay BCA חלבון Kit לנקב 23235
CaCl 2 דיג C79-500
CO 2 גז Airgas (UW-MDS) תקליטור 50
EDTA RPI E57020
EtOH דיג A407SK-4
HCl דיג A142-212
Percoll GE Healthcare 17-0891-01
KH 2 PO 4 דיג P285-500
PierceSDS-PAGE Prep ערכת דוגמאות לנקב 89888
NaCl RPI S23020
NaHCO 3 דיג BP328-500
Na Pho 2 4 דיג S381-500
סוכרוז RPI S24060
מאגר טריס RPI T60040
Tetrodotoxin סיגמא T5651
לייבל Pro Express Mix S35 תג קל פרקין אלמר NEG772
ציוד חברה מספר קטלוגי הערות (אופציונלי)
Dissection כלים
Dounce homogenizer, 7 מ"ל (מגיע עם זכוכית two pestles שכותרתו "A" ו - "B") ויטון
P1000 Gilson Pipetman Gilson F123602
אלגרה צנטריפוגה 6KR Beckman Coulter 366830
GH 3.8 הרוטור, הרוטור דלי Swinging Beckman Coulter 360581
Beckman J2-21 צנטריפוגה Beckman
Beckman צינורות עם כובעים Beckman 355672
מתאמי קירות לבנים Beckman 342327
מתאמי חומה כחול Beckman
JA-17 רוטור, קבוע זווית הרוטור Beckman 369691

טבלה של נוגדנים המשמשים כתמים המערבי:

שם נוגדן חברה מספר קטלוגי מארח המינים דילול פקטור
β-אקטין סיגמא A5441 עכבר 1:2000
GFAP סנטה קרוז SC-65343 עכבר 1:200
GP73 סנטה קרוז SC-134509 ארנב 1:200
HSC70 סנטה קרוז SC-7298 עכבר 1:200
Laminβ סנטה קרוז SC-6261 עז 1:200
Prohibitin סנטה קרוז SC-28259 ארנב 1:200
PSD95 Millipore MAB1596 עכבר 5 מיקרוגרם / μL
SNAP25 AbCam ab5666-100 ארנב 1:2000
Synaptophysin Millipore MAB368 עכבר 1:500
β-3-טובולין סנטה קרוז SC-80016 עכבר 1:200

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Westmark, C. J., Malter, J. S. FMRP mediates mGluR5-dependent translation of amyloid precursor protein. PLoS Biol. 5, e52-e52 (2007).
  2. Westmark, P. R., Westmark, C. J., Wang, S., Levenson, J., O'Riordan, K. J., Burger, C., Malter, J. S. Pin1 and PKMzeta sequentially control dendritic protein synthesis. Sci Signal. 3, ra18-ra18 (2010).
  3. Dunkley, P. R., Heath, J. W., Harrison, S. M., Jarvie, P. E., Glenfield, P. J., Rostas, J. A. A rapid Percoll gradient procedure for isolation of synaptosomes directly from an S1 fraction: Homogeneity and morphology of subcellular fractions. Brain Res. 441, 59-71 (1988).
  4. Dunkley, P. R., Jarvie, P. E., Robinson, P. J. A rapid Percoll gradient procedure for preparation of synaptosomes. Nat. Protoc. 3, 1718-1728 (2008).
  5. Hollingsworth, E. B., McNeal, E. T., Burton, J. L., Williams, R. J., Daly, J. W., Creveling, C. R. Biochemical characterization of a filtered synaptoneurosome preparation from guinea pig cerebral cortex: cyclic adenosine 3':5'-monophosphate-generating systems, receptors, and enzymes. J. Neurosci. 5, 2240-2253 (1985).
  6. Yi, H., Leunissen, J., Shi, G., Gutekunst, C., Hersch, S. A novel procedure for pre-embedding double immunogold-silver labeling at the ultrastructural level. J. Histochem. Cytochem. 49, 279-284 (2001).
  7. Akins, M. R., Berk-Rauch, H. E., Fallon, J. R. Presynaptic translation: stepping out of the postsynaptic shadow. Front. Neural Circuits. 3, (2009).
  8. Jin, I., Kandel, E. R., Hawkins, R. D. Whereas short-term facilitation is presynaptic, intermediate-term facilitation involves both presynaptic and postsynaptic protein kinases and protein synthesis. Learn. Mem. 18, 96-102 (2011).
  9. Lyles, V., Zhao, Y., Martin, K. C. Synapse formation and mRNA localization in cultured Aplysia neurons. Neuron. 49, 349-356 (2006).
  10. Wagatsuma, A., Azami, S., Sakura, M., Hatakeyama, D., Aonuma, H., Ito, E. De Novo synthesis of CREB in a presynaptic neuron is required for synaptic enhancement involved in memory consolidation. J. Neurosci. Res. 84, 954-9560 (2006).
  11. Sutton, M. A., Schuman, E. M. Local translational control in dendrites and its role in long-term synaptic plasticity. J. Neurobiol. 64, 116-131 (2005).
  12. Li, K. -W., Hornshaw, M. P., Van der Schors, R. C., Watson, R., Tate, S., Casetta, B., Jimenez, C. R. Proteomics analysis of rat brain postsynaptic density: implications of the diverse protein functional groups for the integration of synaptic physiology. J. Biol. Chem. 279, 987-1002 (2004).
  13. Peng, J., Kim, M. J., Cheng, D., Duong, D. M., Gygi, S. P., Sheng, M. Semi-quantitative proteomic analysis of rat forebrain postsynaptic density fractions by mass spectrometry. J. Biol. Chem. 279, 21003-21011 (2004).
  14. Kim, S. H., Fraser, P. E., Westaway, D., St. George-Hyslop, P. H. Group II metabotropic glutamate receptor stimulation triggers production and release of Alzheimer's amyloid β42 from isolated intact nerve terminals. J. Neurosci. 30, 3870-3875 (2010).
  15. Weiler, I. J., Greenough, W. T. Potassium ion stimulation triggers protein translation in synaptoneurosomal poiyribosomes. Mol. Cell. Neurosci. 2, 305-314 (1993).
  16. Billard, J. M. Ageing, hippocampal synaptic activity and magnesium. Magnes Res. 19, 199-215 (2006).
  17. Murphy, G. G., Fedorov, N. B., Giese, K. P., Ohno, M., Friedman, E., Chen, R., Silva, A. J. Increased neuronal excitability, synaptic plasticity, and learning in aged Kvbeta1.1 knockout mice. Curr. Biol. 14, 1907-1915 (2004).
  18. Norris, C. M., Halpain, S., Foster, T. C. Reversal of Age-Related Alterations in Synaptic Plasticity by Blockade of L-Type Ca21 Channels. J. Neurosci. 18, 3171-3179 (1998).
  19. Sallert, M., Malkki, H., Segersträlea, M., Tairaa, T., Lauri, S. E. Effects of the kainate receptor agonist ATPA on glutamatergic synaptic transmission and plasticity during early postnatal development. Neuropharm. 52, 1354-1365 (2007).
  20. Quinlan, E. M., Philpot, B. D., Huganir, R. L., Bear, M. F. Rapid, experience-dependent expression of synaptic NMDA receptors in visual cortex in vivo. Nat. Neurosci. 2, 357-35 (1999).
  21. Scheetz, A. J., Nairn, A. C., Constantine-Patton, M. NMDA receptor-mediated control of proteins synthesis at developing synapses. Nat. Neurosci. 3, 211-216 (2000).
  22. Villasana, L. E., Klann, E., Tejada-Simon, M. V. Rapid isolation of synaptoneurosomes and postsynaptic densities from adult mouse hippocampus. J. Neurosci. Methods. 158, 30-36 (2006).
  23. Weiler, I. J., Greenough, W. T. Metabotropic glutamate receptors trigger postsynaptic protein synthesis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90, 7168-7171 (1993).
  24. Gray, E. G., Whittaker, V. P. The isolation of nerve endings from brain: An electron microscopic study of cell fragments derived by homogenization and centrifugation. J. Anat. 96, 79-88 (1962).
  25. Gylys, K. H., Fein, J. A., Yang, F., Cole, G. M. Enrichment of Presynaptic and Postsynaptic Markers by Size-Based Gating Analysis of Synaptosome Preparations From Rat and Human Cortex. Cytometry A. 60, 90-96 (2004).
  26. Hajós, F. An improved method for the preparation of synaptosomal fractions in high purity. Brain Res. 93, 485-489 (1975).
  27. Bai, F., Witzmann, F. A. Synaptosome Proteomics. Subcell. Biochem. 43, 77-98 (2007).
  28. Rao, A., Steward, O. Evidence that protein constituents of postsynaptic membrane specializations are locally synthesized: analysis of proteins synthesized within synaptosomes. J Neurosci. 11, 2881-2895 (1991).
  29. Pertoft, H., Laurent, T. C. Isopycnic separation of cells and cell organelles by centrifugation and modified colloidal silica gradients. Methods of Cell Separation. Catsimpoolas, N. , Plenum Press. New York. 25-65 (1977).
  30. Ramarao, C. S., Acharya, S. R., Krishnan, K. S., Kenkare, U. W. High affinity uptake of L-glutamate and γ-aminobutyric acid in Drosophila melanogaster. J. Biosci. 11, 119-135 (1987).
  31. Munteanu, L. S., Dinu, A. Fractionation of granulocytes from whole human blood by centrifugation. Practical hints. Romanian J. Biophys. 14, 53-58 (2004).
  32. Cell separation composition, kit and method. US patent. , 019713 (1997).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

SynaptoneurosomesMouse CortexPercoll Sucrose GradientDensity Gradient CentrifugationSynaptosome IsolationWestern Blot AnalysisS35 Methionine IncorporationProtein Translation StudiesSynaptic Vesicle UptakeNeurotransmitter Release

Related Articles