מתן תרופות תוך-אף בעכברים באמצעות פיפטה וקנולציה הפוכה להעברת תרופות מאף למוח

תקציר

מקור: Kanazawa, T., et al. שיטות חדשניות למתן תוך-אף בהרדמה באינהלציה להערכת מתן תרופות מהאף למוח. J. Vis. Exp. (2018)

סרטון זה מדגים מתן תוך-אף של תרופות עם תווית רדיו בעכבר מורדם כדי להשיג העברת תרופות מהאף למוח. הוא מסביר כיצד תרופות חוצות את אפיתל האף ונעות דרך מסלולים עצביים כדי להגיע למוח, כמו גם כיצד תנועת הריסים משפיעה על שימור ופינוי תרופות. בנוסף, הסרטון מתאר שיטת קנולציה הפוכה חלופית, הכוללת החדרת צינורית דרך הוושט כדי להעביר תרופות כנגד תנועת הריסים, שיפור השמירה ושיפור יעילות ההובלה.

פרוטוקול

כל ההליכים הכוללים מודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ומועצת הביקורת הווטרינרית של JoVE.

1. בעלי חיים המשמשים למתן תוך-אף תחת הרדמה באינהלציה

1. מאכלסים את עכברי הניסוי בכלובי נירוסטה במחזור אור/חושך של 12 שעות (אור ב-8:00 בבוקר עד 8:00 בערב), עם טמפרטורה מבוקרת שנשמרת על 23 ±-1 מעלות צלזיוס, לחות של 50% ±-10%, וגישה אד-ליביטום למזון ומים.
2. לפני הניסוי, יש להרדים את העכברים באמצעות שאיפה של 2% איזופלורן, לאחר התחלה בריכוז של 4%. אשר את רמת ההרדמה הנדרשת על ידי בדיקת היעלמות יישור פני השטח.

2. הכנת תמיסת הניהול

1. הכן תמיסת מתן של [¹⁴C]-אינולין (50 מיקרומטר, 0.5 μCi/מ"ל לעכבר) על ידי דילול במי מלח עם חוצץ פוספט, ואחסן ב-4 מעלות צלזיוס עד לשימוש.

3. מתן תוך-אף לעכברים

1. בשיטת מיקרופיפטה באמצעות מסכת אינהלציה הניתנת לפתיחה זמנית (איור 1)
   1. קבע עכברים במצב שכיבה על לוח שעם על ידי הדבקת הגפיים שלהם בהרדמה באינהלציה עם איזופלורן 2% (איור 1A).
   2. מתן נפח כולל של תמיסת מתן של 25 מיקרוליטר לכל עכבר במרווחים של 30 שניות, באמצעות מינונים של 1 עד 2 מיקרוליטר הניתנים לחלופין לנחיריים השמאליים והימניים בזמן שהעכברים מקובעים בהרדמה באינהלציה (איור 1B ו-C).
   3. הערה: גז הרדמה פסולת נבלה באמצעים אקטיביים (מכסה אדים, ארון בטיחות ביולוגית קשיח, ואקום וכו') כאשר המסכה נפתחת ובאמצעים פסיביים (פסולת גז הרדמה) כשהיא סגורה.
2. שיטת קנולציה הפוכה מצד דרכי הנשימה דרך הוושט (איור 2)
   1. קבע עכברים במצב שכיבה על לוח שעם על ידי הדבקת הגפיים שלהם בהרדמה באינהלציה עם 2% איזופלורן.
   2. שיער הצוואר מגולח ומוכן באמצעות מריחת בטדין או כלורהקסידין, ולאחר מכן שטיפת אלכוהול.
   3. חשוף את קנה הנשימה והוושט על ידי הרחבת העור מתחת לגרון בעזרת מלקחיים לאחר ביצוע חתך קטן (1.5 ס"מ) במספריים.
   4. בצע חתך (1 מ"מ) בקנה הנשימה בעזרת מספריים.
   5. הכנס צינורית (קוטר פנימי: 0.58 מ"מ, קוטר חיצוני: 0.965 מ"מ) לאורך של 1.2 ס"מ והצמד את הקצה הנגדי של הצינורית לחלק הפנימי של מסכת השאיפה.
   6. בצע חתך (1 מ"מ) בוושט באמצעות מספריים, הכנס צינורית (קוטר פנימי: 0.28 מ"מ, קוטר חיצוני: 0.61 מ"מ) לאורך של 1.4 ס"מ לכיוון החלק האחורי של חלל האף, וקשר אותה (איור 2A ו-B). הערה: פרוצדורות 3.2.2 עד 3.2.4 בוצעו תחת מיקרוסקופ סטריאוסקופי בהגדלה ×10.
   7. חבר מחט (27 גרם × 1/2) למזרק של 1 מ"ל מלא בתמיסת מתן וחבר למשאבת מיקרו-מזרק הניתנת לתכנות.
   8. חבר את המחט הנ"ל לצינורית שהוחדרה לוושט ב-3.2.5 (איור 2C).
   9. נהל נפח כולל של 25 μL [¹⁴C]-תמיסת אינולין בקצב קבוע (5 μL/min) (איור 2C ו-2D).

תוצאות

איור 1: מתן תוך-אף באמצעות מיקרו-פיפטה בשילוב עם מסיכת שאיפה הניתנת לפתיחה זמנית. תצלומים המראים עכבר קבוע (A) עם מסכה סגורה לפני מתן התרופה, (B) תקריב ו-(C) תצוגות שלמות של המסכה הפתוחה במהלך מתן תוך-אף באמצעות פיפטה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
ddY mouse	Japan SLC, Inc.		זכר, 4-6 שבועות, 20-30 גרם
איזופלורן	פייזר	v002139
הגדרת איזופלורן	SHINANO ייצור ושות' בע"מ.	SN-487-OTAir, SN-489-4
מסכת איזופלורן	SHINANO ייצור ושות', בע"מ.		למכרסמים קטנים
מסכת איזופלורן (סוג Opneable)	SHINANO ייצור ושות', בע"מ.		הזמנות מיוחדות
קופסת הרדמה	SHINANO ייצור ושות' בע"מ	SN-487-85-02
מספריים לניסויים בבעלי חיים-1	NATSUME SEISAKUSHO CO., LTD.	B-27H
מספריים לניסויים בבעלי חיים-2	NATSUME SEISAKUSHO CO., LTD.	B-13H
פינצטה-1	FINE SCIENCE TOOLS INC.	11272-30	Dumont #7 Dumoxel
פינצטה-2	NATSUME SEISAKUSHO CO., LTD.	A-12-1
צינור צינורית (PE-50)	בקטון, דיקינסון ושות'.	5069773	תעודת זהות: 0.58 מ"מ, OD: 0.965 מ"מ
צינור צינורית (SP-10)	NATSUME SEISAKUSHO CO., LTD.	KN-392	תעודת זהות: 0.28 מ"מ, OD: 0.61 מ"מ
מכונת גילוח	MARUKAN, LTD.	DC-381
מיקרוסקופ סטריאוסקופי	Olympus Corporation	SZ61
מחט 27G 1/2 ב-13 מ"מ	TERUMO CORPORATION	NN-2738R
מזרק 1 מ"ל	TERUMO CORPORATION	SS-01T
משאבת מזרק	מדעי המוח	NE-1000
מיקרו מרית	Shimizu Akira Inc.	91-0088
Micropipette (0.5-10 uL)	Eppendorf AG	Z368083
שבב פיפטה	Eppendorf AG	0030 000.811
קלטת	TimeMed Labeling System, Inc.	T-534-R	לתיקון עכבר
[¹⁴C]-אינולין	אמריקאי עם תווית רדיו כימיקלים בע"מ	ARC0124A	0.1 mCi/mL
EtOH	Wako Pure Chemical Industries, Ltd.	054-00461