הדמיה של הובלה תוך-תאית של מטען באסטרוציטים מתורבתים

תקציר

מקור: Creighton, B. A., et al. הדמיה וניתוח הובלה תוך-תאית של אברונים ומטענים אחרים באסטרוציטים. J. Vis. Exp. (2019)

סרטון זה מדגים את ההדמיה של הובלת מטען תוך-תאית באסטרוציטים מתורבתים באמצעות בדיקה חומצתית פלואורסצנטית המסמנת באופן סלקטיבי שלפוחיות אנדוליזוזומליות חומציות. הדמיית זמן-lapse ורכישת Z-stack עם מיקרוסקופ קונפוקלי מאפשרים מעקב אחר מטען עם תווית פלואורסצנטית לאורך נפח התא התלת מימדי. הניתוח מבדיל בין מטען נייח למטען הנע לעבר פריפריית התא או הגרעין, ומספק תובנות לגבי דינמיקת הובלה תוך-תאית.

פרוטוקול

1. טרנספקציה של פלסמידים מתויגים פלואורסצנטית

1. יום לפני טרנספקציה או תיוג, זרע אסטרוציטים בצפיפות הרצויה להדמיה 24-48 שעות לאחר הטרנספקציה. צפיפות מומלצת עבור צלחות 24 בארות או בארות תחתית זכוכית 14 מ"מ היא 2 x 104 תאים/באר.
   הערה: פרוטוקול זה מותאם להעברה של אסטרוציטים מצופים על כיסויי זכוכית 12 מ"מ על צלחות 24 בארות או בארות תחתית זכוכית 14 מ"מ בשיטה מבוססת ליפופקציה. יש לשנות את קנה המידה של ריאגנטים בהתאם לגודל צלחת התרבות שבה גדלים האסטרוציטים.
2. לדלל את מגיב הליפופקציה (טבלת החומרים) במדיה מופחתת סרום (טבלת חומרים). כדי לייעל את היחס בין מגיב ליפופקציה ל-DNA, בדוק מגוון של דילולים נאותים. לדוגמה, אם משתמשים במגיב המשמש בפרוטוקול זה (טבלת חומרים), יש לדלל 2, 3, 4 ו-5 מיקרוליטר של מגיב הליפופקציה ב-50 מיקרוליטר של מדיה מופחתת בסרום.
3. לדלל 5 מיקרוגרם של DNA בטוהר גבוה ב-250 מיקרוליטר של מדיה מופחתת בסרום. הוסף 5 מיקרוליטר של מגיב משפר ליפופקציה (טבלת חומרים). שלב את הצינור המכיל את מגיב הליפופקציה עם נפח שווה של תערובת משפר ה-DNA-lipofection. מערבבים על ידי פיפטינג ודוגרים בטמפרטורת החדר (RT) למשך 15 דקות.
4. הסר את מצע תרבית האסטרוציטים והוסף תערובת טרנספקציה (שלב 1.3) לתאים טיפתיים. לאחר דגירה של 6 שעות ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2, החלף את קומפלקס הטרנספקציה בנפח מתאים של מצע תרבית אסטרוציטים (2 מ"ל עבור כלי זכוכית תחתונים של 14 מ"מ). דגירה למשך 24-72 שעות נוספות לפני שתמשיך לרכישת התמונה. עקוב מקרוב אחר משך שלב הדגירה כדי להשיג את האיזון הטוב ביותר בין ביטוי החלבון לבין כדאיות התא.

2. תיוג של אנדוזומים/ליזוזומים מאוחרים באמצעות בדיקות פלואורסצנטיות

הערה: ניתן לתייג מטענים מסוימים באמצעות צבעים פלואורסצנטיים בעלי זיקה גבוהה לחלבונים ספציפיים למטען. הדוגמה הבאה מאפשרת תיוג של אנדוזומים/ליזוזומים מאוחרים עם בדיקה חומצתית פלואורסצנטית.

1. לדלל את בדיקת התיוג הליזוזומלי (טבלת החומרים) ב-200 מיקרוליטר של מצע תרבית אסטרוציטים לריכוז עבודה של 1 מיקרומטר ולמרוח על אסטרוציטים משלב 1.1 בצפיפות של 2 x 104 תאים/באר. יש לדגור למשך 30 דקות בחום של 37 מעלות צלזיוס.
2. שטפו את התאים פעם אחת במצע תרבית אסטרוציטים חם והחליפו באמצעי הדמיה (טבלת חומרים). המשך מיד להדמיה חיה.

3. רכישת תמונה באמצעות מערכת הדמיה זמן-lapse

הערה: הדמיה חיה בזמן-lapse צריכה להיעשות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי המצויד במצלמה מהירה, מיקוד מוגדר, תא דגירה ואובייקט שמן פי 40 עם צמצם מספרי גבוה (למשל, Plan-Apochromat 1.4NA). מגוון תוכנות רכישה זמינות להדמיית זמן-lapse. בחירת מערכת המיקרוסקופיה ותוכנת הרכישה צריכה להתבסס על זמינותם והתאמתם למטרות המחקר המסוים. להלן כמה הנחיות כלליות.

1. הנח את תא התרבות או הצלחת במתאם המתאים על במת המיקרוסקופ. באמצעות אור אפיפלואורסצנטי, בחר את התאים המבטאים חלבונים פלואורסצנטיים או בדיקה להקלטה. כוונן את תאורת הדגימה הפלואורסצנטית כדי לדמיין את התא/ים שנבחרו באמצעות המצלמה הדיגיטלית. הימנע משימוש בתאורה גבוהה שעלולה לגרום להלבנת אור ופוטוטוקסיות. התאימו את המיקוד והזום.
2. רכוש סדרות זמן-lapse של Z-stack בודדות בתדר של מסגרת אחת כל 2 שניות עבור מרווחי זמן הנעים בין 300 שניות ל-500 שניות באמצעות פונקציות הזום והמיקוד המוגדר.
   הערה: דינמיקת הסחר (מהירות, תדירות תנועה וכו') תשתנה בהתאם לחלבון המעניין, לפיכך, מהלך הזמן של הרכישה עשוי לדרוש התאמה. לדוגמה, מיטוכונדריה פחות תנועתית מליזוזומים ומציגים הפסקות תכופות. במקרה זה, מתאים יותר להתאים את פרמטרי הרכישה למסגרת אחת כל 5 שניות למשך 800 שניות.
3. שמרו תמונות עם קיטועי זמן וייצאו אותן כקובצי אוסף AVI או TIFF.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
Dulbecco's Modified Eagle Medium Gen	Clone	25-500
Fetal Bovine	Serum Gemini	100-106	Fet-Inactivated
FIJI (Fiji is Just Image J)	NIH	Version 1.52i
פינצטה עם קצה עדין	FST	11254-20	סגנון #5
מקור אור פלואורסצנטי	Excelitas	012-63000	X-Cite 120Q
כלי תחתית זכוכית	תאגיד מטק	P35G-1.5-14-C	צלחת 35 מ"מ | מס' 1.5 כיסוי | קוטר זכוכית 14 מ"מ | מלקחיים לא מצופים
Graefe	F.S.T	11054-10	מלקחיים של איריס Graefe עם קצוות מעוקלים
צבע פלואורסצנטי ירוק שמכתים תאים חומציים (אנדוזומים וליזוזומים מאוחרים)	Life Technologies	L7526	LysoTracker ירוק DND 26. מומס מראש ב-DMSOS לתמיסת מלאי של 1 מ"מ. יש לדלל לריכוז העבודה הסופי במצע הגידול או במאגר הנבחר.
תמיסת המלח המאוזנת של האנק (10x)	Gibco	14065-056	ללא מגנזיום וסידן
		A14291DJ	תמיסת הדמיה של תאים חיים
מיקרוסקופ קונפוקלי הפוך	Zeiss		LSM 780
KymoToolBox			https://github.com/fabricecordelieres/IJ_KymoToolBox
Lipofection Enhancer Reagent	Life Technologies	11514015	Plus Reagent
Lipofection Reagent	Life Technologies	15338100	Lipofectamine LTX reagent
חממת טלטול אורביטלית	ניו ברונסוויק סיינטיפיק	8261-30-1008	Innova 4230, חממת טלטול מסלולית עם בקרת טמפרטורה ומהירות
תמיסת פניצילין/סטרפומיצין (100x)	Gen Clone	25-512
פוספט חוצץ מלח (10x)	Gen Clone	25-507x
Poly-D-Lysine Hydrobromide	Sigma	P7405	מתמוסס ב-Tris buffer, pH 8.5, ב-1 מ"ג/מ"ל. מקפיאים לאחסון לטווח הארוך. הימנע ממחזורי הקפאה והפשרה
מדיום סרום מופחת	Gibco	31985-062	OPTI-MEM
צלוחיות תרבית רקמות	Olympus Plastics	25-209	75 ס"מ^2. 100% גישה לצוואר זוויתי, מכסה מסנן מאוורר הידרופובי 0.22um
חממת תרבית רקמות	Thermo Scientific	51030285	HERAcell VIOS 160i, חממת תרבית רקמות עם בקרת טמפרטורה, לחות ו-CO2
Tris-Base	Sigma	T1503	8.402 גרם מומס לליטר אחד במים עם 4.829 גרם Tris HCl ליצירת 0.1 M Tris buffer, pH 8.5
Tris-HCl	Sigma	T3253	4.829 גרם מומס לליטר אחד במים עם 8.402 גרם Tris Base ליצירת 0.1 M Tris buffer, pH 8.5

של טכנולוגיות חיים של מדיה הדמיה