הדמיה קונפוקלית תלת-ממדית ברזולוציה גבוהה של מחסום הדם-מוח בקטע מוח של עכבר

תקציר

מקור: Villaseñor, R and Collin. L. הדמיה קונפוקלית ברזולוציה גבוהה של מחסום הדם-מוח: הדמיה, שחזור תלת מימד וכימות של טרנסציטוזיס. J. Vis. Exp. (2017)

סרטון זה מדגים הדמיה תלת מימדית ברזולוציה גבוהה של מחסום הדם-מוח (BBB) באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית, המציגה קטעי מוח של עכבר מוכתמים בנוגדנים לניתוח רכיבי BBB ומבנים תוך-תאיים, ישים לחקר הומאוסטזיס מוחי, אינטראקציות נוירו-וסקולריות ותפקוד לקוי של BBB הקשור למחלה.

פרוטוקול

כל ההליכים הכוללים דגימות של בעלי חיים נבדקו ואושרו על ידי ועדת הביקורת האתית המתאימה לבעלי חיים.

1. הדמיה קונפוקלית ברזולוציה גבוהה של מחסום הדם-מוח
2. בצע רכישת תמונה עם מיקרוסקופ קונפוקלי מתאים לסריקת לייזר (ראה טבלת חומרים) עם קווי לייזר ב-405, 488, 561 ו-633 ננומטר לעירור של פלואורופורים באזורים הכחולים, הירוקים, הכתומים והאדומים של ספקטרום האור. לרכישת תמונה, השתמש באובייקט שמן 63X עם צמצם מספרי של 1.4.
3. בתפריט הרכישה של התוכנה השולטת במיקרוסקופ, הגדר את פרמטרי רכישת התמונה. בתפריט הנפתח של 'גודל תמונה', בחר ערך של 1024 x 1024 פיקסלים. שנה את גודל הפיקסלים לערך בין 200 ל-300 ננומטר על ידי התאמת הערך של תפריט 'זום'."
   הערה: לניתוח מבנים תוך-תאיים, הקטן את גודל הפיקסלים ל-75 ננומטר. הגדרת גודל תמונה זו מגדילה באופן משמעותי את זמן הרכישה וניתן להקטין אותה ל-512 x 512 פיקסלים כדי להפחית את זמן הרכישה על ידי הדמיית שדה ראייה קטן יותר.
4. בתפריט הנפתח 'מהירות רכישה', בחר ערך של 400 הרץ, כלומר 400 שורות לשנייה. בתפריט 'הגדרות מערכות', בחר בתפריט הנפתח 'עומק פיקסלים' ושנה את הערך ל-12 סיביות.
5. בתוכנת המיקרוסקופ, בכרטיסייה 'רכישה', הפעל את האפשרות לרכישת מסגרת רציפה. הגדר את עובי החתך האופטי לערך בין 0.75 ל-1 מיקרומטר עבור כל ערוץ על ידי שינוי הערך בתפריט 'חור סיכה'.
6. בפאנל לעירור פלואורסצנטי, הפעל את הלייזר הנדרש כדי לעורר בצורה אופטימלית את הפלואורופורים בדגימה, למשלample, קו לייזר של 488 ננומטר עבור פלואורופור פולט ירוק.
   הערה: השתמש במציג ספקטרום פלואורופור (ראה טבלת חומרים) כדי לבחור את לייזר העירור המתאים.
7. בפאנל לזיהוי פלואורסצנט, הזז את המחוון כדי לבחור את אורכי הגל שיימדדו בכל ערוץ, למשלample, בין 510 ל-550 ננומטר עבור פלואורופור פולט ירוק.
   הערה: השתמש בספקטרום פלואורופור viewer (ראה טבלת חומרים) כדי לבחור את אורכי גל הזיהוי המתאימים.
8. הוסף טיפה של שמן טבילה עם מקדם שבירה של 1.52 על גבי הכיסוי עם קטע המוח כדי להתאים את מקדם השבירה של כיסוי הזכוכית והמטרה. הנח את הדגימה במיקרוסקופ והפעל את מנורת האפיפלואורסצנט כדי לדמיין את הדגימה באמצעות משקפת המיקרוסקופ.
9. באמצעות הכפתורים במעמד המיקרוסקופ, החלף את גלגל המסנן כדי לבחור מסנן המתאים להמחשת גרעינים מוכתמים DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole). השתמש במיקוד הגס כדי להביא את האות מגרעינים מוכתמים ב-DAPI למיקוד.
10. באמצעות הכפתורים במעמד המיקרוסקופ, החלף מסננים כדי להמחיש את האות מסמני כלי דם (לדוגמה, CollagenIV או CD31) ומרכז את שדה הראייה על מקטע נימי בודד.
11. לחץ על הכפתור כדי להפעיל את מצב הסריקה החיה. במהלך הסריקה, התאם את הרווח ועוצמת הלייזר עבור כל ערוץ כדי למקסם את הטווח הדינמי של התמונות ולהימנע מרוויית פיקסלים.
    הערה: השתמש בטבלת חיפוש המתייגת פיקסלים רוויים כדי להעריך חזותית רוויית יתר. כדי למנוע רוויית יתר של האות, התאם את ההגדרות עם הדגימה שצפויה להיות בעלת האות הפלואורסצנטי הגבוה ביותר.
12. הגדר את הערך עבור ממוצע קו ל-2.
    הערה: בעת שימוש במהירויות רכישה גבוהות יותר, הגדל ערך זה כדי להפחית את הרעש.
13. קבע קטעי התחלה וסיום לביצוע ערימות z אופטיות המשתרעות על כל נפח הנימים. השתמש בגודל צעד של 0.45 μm.
    הערה: אם התמונות ישמשו לכימות הבא, שמור על אותן הגדרות רכישה עבור ערכת הנתונים המלאה.
14. לצורך כמות, רכוש 10 עד 20 ערימות z לכל קטע משלושה עכברים שונים לפחות לצורך השוואות סטטיסטיות.
    הערה: רכוש את מערך הנתונים המלא באותו מפגש כדי להפחית את השונות הנובעת מהלבנת הדגימה ותנודות עוצמת הלייזר.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
Rat monoclonal antibody ER-MP12 כנגד CD31/PECAM	Novus Biologicals	MCA2388	Labels תאי אנדותל במוחהשתמש בדילול 1:100 עם חמור פוליקלונלי אנטי-חולדה IgG (H+L) יחד עם צבע AlexaFluor מתאים, המשמש בדילול 1:400
נוגדן חד שבטי של חולדה נגד Podocalyxin	מערכות מו"פ	MAB1556	תוויות לומן של נימיםהשתמש בדילול 1:100זיהוי עם IgG פוליקלונלי נגד חולדות של חמור (H+L) יחד עם צבע AlexaFluor מתאים, המשמש בדילול 1:400
נוגדן רב-שבטי ארנב נגד CollagenIV	Biotrend	BT21-5014-70	תוויות קרום מרתף של נימיםשימוש בדילול 1:100זיהוי עם IgG אנטי-ארנב פוליקלונלי של חמור (H+L) יחד עם צבע AlexaFluor מתאים, המשמש בדילול 1:400
נוגדן פוליקלונלי עיזים כנגד CD13	מערכות מו"פ	AF2335	תוויות פריציטיםהשתמש בדילול 1:100זיהוי עם IgG פוליקלונלי נגד עזים של חמור (H+L) יחד עם צבע AlexaFluor מתאים, המשמש בדילול 1:400
שיבוט נוגדן חד שבטי של עכבר G-A-5 נגד GFAP בשילוב עם Cy3	Abcam	ab49874	תוויות אסטרוציטיםהשתמש בדילול 1:100
נוגדן רב-שבטי ארנב נגד Iba-1	Wako	019-19741	תוויות מיקרוגליההשתמש בדילול 1:100זיהוי עם חמור פוליקלונלי אנטי-חולדה IgG (H+L) יחד עם צבע AlexaFluor מתאים, המשמש בדילול 1:400
נוגדן חד שבטי עכברוש ABL93 gainst LAMP2	פיצג'רלד	10R-CD107BBMSP	תוויות ליזוזומיםהשתמש בדילול 1:100זיהוי עם חמור פוליקלונלי אנטי-חולדה IgG (H+L) יחד עם צבע AlexaFluor מתאים, המשמש בדילול 1:400
נוגדן רב-שבטי של חמור נגד עכבר IgG (H+L) AlexaFluor594	LifeTechnologies	A21203	שימוש בדילול 1:400
נוגדן רב-שבטי של חמור נגד עכבר IgG (H+L) AlexaFluor488	LifeTechnologies	A21202	שימוש בדילול 1:400
נוגדן פוליקלונלי עז נגד עכבר IgG (H+L) AlexaFluor555	LifeTechnologies	A21422	שימוש בדילול 1:400
מדיום הרכבה פלואורסצנטי	Dako	S3023	מדיום הרכבה פלואורסצנטי Dako
סריקת לייזר מיקרוסקופ קונפוקלי	Leica Microsystems	NA	Leica TCS SP8 X עם גלאי HyD ולייזר אור לבן
תוכנת עיבוד תמונה	Leica Microsystems	NA	Leica Application Suite AF גרסה 3.1.0 לבנות 8587
תוכנת ניתוח תמונה	Bitplane תוכנה מדעית	NA	Imaris גרסה 7.6.5 לבנות 31770 עבור x64
Fluorescence SpectraViewer	ThermoFisher Scientific	NA	https://www.thermofisher.com/ch/en/home/life-science/cell-analysis/labeling-chemistry/fluorescence-spectraviewer.html