הדמיית מצב חמצון חיזור מיטוכונדריאלי בתאי עצב ראשוניים באמצעות אינדיקטור רציומטרי

תקציר

מקור: Katsalifis, A., et al. הדמיה חיה של מצב חמצון חיזור גלוטתיון מיטוכונדריאלי בנוירונים ראשוניים באמצעות אינדיקטור רציומטרי. J. Vis. Exp. (2021)

סרטון זה מדגים את ההדמיה של מצב חמצון חיזור מיטוכונדריאלי בתאי עצב ראשוניים באמצעות מחוון פלואורסצנטי רציומטרי. על ידי החלת שני אורכי גל עירור תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי, נמדד יחס עוצמת הקרינה כדי להעריך חמצון מיטוכונדריאלי. הפרוטוקול כולל גירוי N-methyl-D-aspartate (NMDA) כדי לגרום לזרם סידן וייצור מיני חמצן תגובתיים (ROS), ולאחר מכן כיול באמצעות חומרים מחמצנים ומפחיתים כדי לכמת חמצון מיטוכונדריאלי המושרה על ידי NMDA.

פרוטוקול

1. טעינת תאים עם Tetramethylrhodamine ethyl ester perchlorate (TMRE)

הערה: בפרוטוקול זה, נעשה שימוש ב-TMRE במצב שאינו מרווה בריכוז סופי של 20 ננומטר. באופן כללי, יש להשתמש בריכוז הנמוך ביותר האפשרי של TMRE שעדיין מספק עוצמת אות מספקת במיקרוסקופ הנבחר. עקב אידוי לא אחיד, נפח המדיום בבארות שונות יכול להיות שונה בתרבויות ראשוניות ארוכות טווח. כדי להבטיח ריכוז TMRE עקבי בכל הבארות, אל תוסיף TMRE ישירות לבארות. במקום זאת, החלף את המדיום בכל באר באותה כמות של מדיום המכיל TMRE. הפרוטוקול שלהלן מיועד לנוירונים ראשוניים בצלחות של 24 בארות המכילות ~1 מ"ל של מדיום לבאר.

1. עובדים במכסה מנוע זרימה למינארי של תרבית רקמות, אוספים 500 מיקרוליטר של מדיום מכל באר לצינור חרוטי יחיד.
2. לכל באר, הוסף 0.5 מיקרוליטר של מלאי TMRE של 20 מיקרומטר לתוך הצינור החרוטי (למשל, 12 מיקרוליטר עבור 24 בארות).
3. שאפו בזהירות את המדיום שנותר מהבאר הראשונה והחליפו אותו ב-500 מיקרוליטר של מדיום המכיל TMRE. המשיכו, טוב אחר טוב, עם הבארות הנותרות.
   הערה: הקפידו לא לתת לתאים להתייבש ולא להפריע לתאים.
4. החזירו את התאים לחממה והמתינו לפחות 60 דקות לאיזון הצבע.
   הערה: ניתן להאריך את זמן הטעינה למספר שעות ללא תופעות לוואי.
5. כדי להבטיח ריכוז ושיווי משקל עקביים של TMRE לאורך כל ניסוי ההדמיה, הקפד לכלול ריכוז סופי של 20 ננומטר TMRE במאגר ההדמיה ובכל פתרונות הגירוי.

2. אופטימיזציה של הגדרות מיקרוסקופ קונפוקלי סריקה

הערה: שלב זה נועד למצוא את הפשרה הטובה ביותר בין איכות התמונה לכדאיות התא במהלך הדמיה חיה. סעיף זה מתאר את האופטימיזציה של הגדרות להדמיית חלבון פלואורסצנטי ירוק רגיש לחמצון (roGFP). אם מבוצעת הדמיה רב-פרמטרית, יש לבצע אופטימיזציה דומה, כולל בדיקת קו בסיס יציב ללא סימני הלבנה או פוטוטוקסיות, עבור האינדיקטורים הנוספים.

1. הפעל את המיקרוסקופ הקונפוקלי וטען את ההגדרות הסטנדרטיות להדמיית GFP (עירור של 488 ננומטר, פליטה של 505 - 550 ננומטר).
2. הגדר את הגלאי ל-12 סיביות או 16 סיביות. הערה: בדרך כלל, 8 סיביות אינן מספיקות להדמיה כמותית.
3. הפעל את מצב הסריקה הרציף והוסף רצף/רצועה שנייה (עירור של 405 ננומטר, פליטה של 505 - 550 ננומטר).
4. עבור שני הערוצים, בחר טבלת חיפוש פסאודו-צבע המציינת פיקסלים עם חשיפת יתר ותת-חשיפת (לדוגמה, GLOW OU).
5. בחר מטרה המתאימה למושא העניין.
   הערה: 10x-40x מתאימים לניתוח תא בודד, 63x-100x מתאימים לניתוח מיטוכונדריון יחיד.
6. התקן כיסוי עם תאים לתוך תא ההדמיה, הוסף 1 מ"ל של מאגר הדמיה והנח את החדר על המיקרוסקופ.
7. השתמש בעינית ובאור המועבר כדי למקד את התאים.
   הערה: אל תשתמש באור אפיפלואורסצנטי כדי לאתר ולמקד תאים. אפילו בהספק נמוך, זה ישפיע לרעה על התאים.
8. הקלט תמונות עם פורמטים שונים של פיקסלים. בהתבסס על תמונות אלה, בחר את מספר הפיקסלים הנמוך ביותר שנותן רזולוציה מקובלת של המבנה המבוקש.
   הערה: בדרך כלל, 512 x 512 פיקסלים עובדים היטב עבור הדמיה של תא יחיד עם יעדים של 20x ו-40x, ו-1024 x 1024 או 2048 x2048 פיקסלים עובדים בדרך כלל היטב עבור הדמיית מיטוכונדריון יחיד עם מטרה של 63x.
9. הקלט תמונות בגדלים שונים של חורים. בהתבסס על תמונות אלה, בחר את גודל החור הגדול ביותר שנותן רזולוציה מקובלת של מבנה העניין.
   הערה: בדרך כלל, 3-7 יחידות אווריריות עובדות היטב.
10. הקלט תמונות בעוצמות לייזר שונות.
    1. התאם את הרווח והסף של הגלאי בהתאם. בהתבסס על תמונות אלה, בחר את עוצמת הלייזר הנמוכה ביותר המספקת עוצמת אות מקובלת ויחס אות לרקע.
       1. כדי לקבוע את יחס האות לרקע, מדוד את עוצמת האות באזור עניין (ROI) המכיל תאים או מיטוכונדריה (ROI1) ובהחזר ROI ללא תאים או מיטוכונדריה (ROI2). לאחר מכן, חלקו את עוצמת ה-ROI1 בעוצמת ה-ROI2.
          >הערה: כוונו ליחס אות לרקע של >3 ועוצמות אות של החזר ROI בודד של 200-1,000 עבור עירור של 405 ננומטר עם 1-3% עוצמת לייזר ועוצמות של החזר ROI בודד של 300-1,500 עבור עירור של 488 ננומטר עם 1% עוצמת לייזר.
11. הקלט תמונות עם מהירויות סריקה שונות ומספר ממוצעי פריימים שונים. הקלט 4-5 תמונות עבור כל שילוב של הגדרות. בהתבסס על סדרות תמונות אלה, בחר את הגדרות המהירות הגבוהה ביותר והממוצע הנמוך ביותר שנותנות רעש תמונה מקובל ושונות מתמונה לתמונה.
    הערה: מהירות סריקה של 600 הרץ ו-1-2 פריימים לממוצע עובדים היטב ברוב המקרים.
12. באמצעות כיסוי חדש, הקלט סדרת זמן-lapse עם ההגדרות המותאמות.
    הערה: משך הזמן ומרווח התמונה של הסדרה צריכים להיות דומים לאלה של הניסויים המתוכננים.
13. בסוף סדרת זמן-lapse, הוסף 1 מ"ל של תמיסת דיאמיד (DA) 2x לתא ההקלטה. תמונה למשך 2 דקות נוספות.
14. שאפו את מאגר ההדמיה באמצעות משאבה פריסטלטית או פיפטה ידנית. הוסף 1 מ"ל של תמיסת 1x Dithiothreitol (DTT). תמונה למשך 5 דקות נוספות.
15. נתח את ניסוי דולג הזמן.
    1. ודא שאף אחד משני הערוצים לא נחשף יתר על המידה או תת-חשיפה במהלך טיפול DA- ו-DTT עם ההגדרות המותאמות.
    2. ודא שאף אחד משני הערוצים לא מציג הלבנה ניכרת במהלך הקלטת דולג הזמן; כוון לאובדן עוצמה של <2% בין התמונה הראשונה לאחרונה.
    3. ודא שהיחס 405:488 אינו משתנה במידה ניכרת במהלך ההדמיה.
16. חזור על כל ההליך בצורה איטרטיבית, תוך שימוש במספר תלושי כיסוי, עד שהוגדרו הגדרות המספקות באופן עקבי תוצאות מקובלות.

3. הערכת מצב חמצון חיזור בסיסי

1. הפעל את המיקרוסקופ וטען את ההגדרות המותאמות מסעיף 2.
2. הגדר את ממוצע המסגרת ל-3-5.
3. התקן כיסוי עם תאים לתוך תא ההדמיה, הוסף 1 מ"ל של מאגר הדמיה והנח את החדר על המיקרוסקופ.
4. השתמש בעינית ובאור המועבר כדי למקד את התאים.
   הערה: אל תשתמש באור אפיפלואורסצנטי כדי לאתר ולמקד תאים. אפילו בהספק נמוך, זה ישפיע לרעה על התאים.
5. עבור למצב סריקה והשתמש בערוץ 488 ננומטר בתצוגה חיה כדי להתמקד ולאתר תאים להדמיה.
6. השתמש בפונקציה מרובת הנקודות כדי לבחור 3-5 שדות של view על הכיסוי.
7. הקלט תמונת קו בסיס.
8. הוסף 1 מ"ל של תמיסת DA 2x לתא.
9. לאחר 1, 2 ו-3 דקות, השתמש בתצוגה חיה כדי לאשר/להתאים את המיקוד ולאחר מכן להקליט תמונה.
   הערה: תאים בדרך כלל מתחמצנים לחלוטין לאחר 2 דקות.
10. החלף את המאגר בתא ההדמיה ב-1 מ"ל של תמיסת DTT 1x.
11. לאחר 3 ו-5 דקות, השתמש בתצוגה חיה כדי לאשר/לכוונן את המיקוד ולאחר מכן להקליט תמונה.
    הערה: תאים מצטמצמים בדרך כלל במלואם לאחר 4-5 דקות.

4. הדמיה חיה של טיפולים אקוטיים

הערה: הפרוטוקול שלהלן מתאר הדמיה של תגובת החמצון החיזור המיטוכונדריאלי לטיפול ב-NMDA. ייתכן שיהיה צורך להתאים את מרווחי התמונה ומשך הניסוי לטיפולים אחרים.

1. הפעל את המיקרוסקופ וטען את ההגדרות המותאמות מסעיף 3.
2. הגדר את מרווח הזמן ל-30 שניות ואת משך הזמן ל-25 דקות.
3. הרכיב כיסוי עם תאים לתוך תא ההדמיה, הוסף 1 מ"ל של מאגר הדמיה והנח את החדר על המיקרוסקופ.
   הערה: כדי למנוע סחיפה של מיקוד תרמי, השאר את התאים על שלב המיקרוסקופ למשך 10-15 דקות לפני תחילת הדמיית זמן-lapse.
4. השתמש בעינית ובאור המועבר כדי למקד את התאים.
   הערה: אל תשתמש באור אפיפלואורסצנטי כדי לאתר ולמקד תאים. אפילו בהספק נמוך, זה ישפיע לרעה על התאים.
5. עבור למצב הסריקה והשתמש בערוץ 488 ננומטר בתצוגה חיה כדי להתמקד ולאתר תאים להדמיה.
6. אופציונלי: כדי להגדיל את מספר התאים המוקלטים בכל ריצה, השתמש בפונקציה מרובת הנקודות כדי לדמות 2-3 שדות ראייה לכל תלוש כיסוי.
7. התחל את רכישת זמן-lapse והקלט 5 תמונות כהקלטה בסיסית של 2 דקות.
8. הוסף 500 מיקרוליטר של תמיסת NMDA 3x לתא (ריכוז סופי 30 מיקרומטר) והקלט 20 תמונות נוספות כתגובת NMDA של 10 דקות.
   הערה: נוירונים רגישים מאוד לשינויים באוסמולריות. לכן, הקפד למזער את האידוי של מאגר ההדמיה. לטיפולים ארוכים יותר, יש לכסות את תא ההדמיה במכסה.
9. הוסף 500 מיקרוליטר של תמיסת DA 4x לתא והקלט 6 תמונות נוספות (כיול מקסימלי של 3 דקות).
10. שאב את המאגר מתא ההדמיה והחלף אותו ב-1 מ"ל של תמיסת DTT 1x. הקלט 10 תמונות נוספות (כיול מינימלי של 5 דקות).
11. סיים את ההקלטה ושמור את סדרת התמונות.

חומרים