הדמיה תלת מימדית של אסטרוציטים בעלי תווית חיסונית באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית

Abstract

מקור: Bagheri, M., et. al. פרוטוקול לניתוח מורפומטרי קונפוקלי תלת מימדי של אסטרוציטים. J. Vis. Exp. (2015).

סרטון זה מדגים הדמיה של אסטרוציטים עם תווית פלואורסצנטית בקטע מוח של עכבר באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי. חלק המוח ממוקם תחת עדשת האובייקט המתאימה, ונבחרים פלואורופורים ומסננים מתאימים. לאחר אופטימיזציה של החשיפה באופן אוטומטי, פרמטרי הסריקה מוגדרים כדי להבטיח תמונות דו-ממדיות ברזולוציה גבוהה. פרמטרים של מחסנית Z מוגדרים, ותמונות תלת מימד מתקבלות.

Protocol

כל ההליכים הכוללים דגימות של בעלי חיים נבדקו ואושרו על ידי ועדת הביקורת האתית המתאימה לבעלי חיים.

1. בעלי חיים, ניתוחים והכנת דגימות

הערה: הכינו רקמת מוח לניתוח מיקרוסקופי קונפוקלי תלת מימדי (תלת מימד).

1. חלקו את בעלי החיים באופן אקראי לשתי קבוצות: עמילואיד בטא (Aβ)_{1-40-הזרקה} (n = 8), ו-Aβ_1-40-2012 הזרקה עם טיפול בגינישטאין (n = 8); מתן גניסטאין (10 מ"ג/ק"ג מדולל ברכב כגון שמן קיק פוליאתוקסילטי) על ידי הזרקה שעה אחת לפני הניתוח.
2. הרדמו את בעלי החיים עם קטמין (100 מ"ג/ק"ג) וקסילזין (10 מ"ג/ק"ג). אשר הרדמה נכונה על ידי היעדר רפלקס נסיגה לאחר צביטת הבוהן. השתמש במשחה על העיניים במהלך הניתוח למניעת יובש.
3. הניחו בעלי חיים במנגנון סטריאוטקסי וגלחו את הראש. יש למרוח תמיסת יוד כדי לנקות את הקרקפת לפני החתך ולשמור על מקום הניתוח סטרילי במהלך הניתוח כדי להפחית את הסיכון לזיהום. הזרקו Aβ_1-40 באופן סטריאוטקסי (4 מיקרוליטר) בהיפוקמפוס ב-3.5 מ"מ אחורי לברגמה, ±-2 מ"מ לרוחב לקו האמצע ו-2.8 מ"מ מתחת לדורה, על פי אטלס מוח חולדות.
4. ספק תצפית/טיפול לאחר הניתוח עד שבעלי החיים יהיו בהכרה מלאה כדי להבטיח את נוחות בעלי החיים. שמור על חום בעלי החיים במהלך ההחלמה, ואל תחזיר אותם לכלוב עם בעלי חיים אחרים עד להחלמה מלאה. שימו לב לכל סימני זיהום בבעלי החיים לאחר הניתוח.
5. הרדמה עמוקה של בעלי החיים על ידי קטמין (150 מ"ג/ק"ג) שלושה שבועות לאחר הניתוח. בצע קיבוע טרנס-קרדיאלי על ידי החדרת בעלי החיים עם 0.9% מי מלח ואחריו 4% פרפורמלדהיד במי מלח פוספט 0.1 M או PBS (pH = 7.4), ואז הסר ותקן את המוח.
6. לאחר תיקון המוח ב-4% פרפורמלדהיד למשך 2-3 ימים ב-4 מעלות צלזיוס.
7. הטמע את הרקמה בגושי פרפין באמצעות ציוד להטמעת רקמות, והימנע ממילוי חסר או מילוי יתר של הקסטה מכיוון שהיא עלולה להפריע ליישור או לחתך הנכון. שימו לב לכיוון הרקמה בגוש הפרפין.
   הערה: ההיפוקמפוס של החולדה, למשל, קרוב לחלק האחורי של חצי המוח. לפיכך, יש להטמיע את הרקמה באופן שהחתך מתחיל בחלק האחורי של המוח. השתמש באטלס Paxinos כמדריך כדי להגיע למבנה האנטומי הרצוי.
8. הנח את המיקרוטום הרחק מטיוטות אוויר או פתחים מכיוון שתנועות אוויר מקשות על הטיפול בחלקים.
9. השתמשו במקטעים בעובי ≥20 מיקרומטר, מכיוון שעומק זה יהיה הכרחי כדי לייצר תמונות Z-Stack של אסטרוציטים שלמים. אל תשתמש בשני החלקים הראשונים, מכיוון שייתכן שיש להם עובי לא רצוי עקב התפשטות תרמית.
10. הנח את החלקים על פני מים חמים (5 ± 2 מעלות צלזיוס, מתחת לטמפרטורת ההיתוך של פרפין) מספיק זמן כדי לשטח את החלקים.
    הערה: הרחבת יתר של הקטע עלולה להפריע למורפולוגיה של המבנה. השתמש במכחול זעיר כדי להעביר בזהירות חלקים. אסוף שניים עד שלושה מקטעים בכל שקופית.
11. אחסן את השקופיות ברשת זקופה ותן להן להתייבש בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך מספר שעות או למשך הלילה (O/N).

2. אימונוהיסטוכימיה

1. דפראפין חלקים בקסילן, 2 x 10 דקות, והתייבשות באמצעות שיפוע אלכוהול (99.8%, 95% ו-70%, 10 דקות כל אחד) ו-PBS.
2. דגירה עם נוגדנים כנגד חלבון חומצי סיבי גליה (GFAP) מדולל 1:1,500 ב-PBS המכיל 0.25% אלבומין בסרום בקר (BSA), 0.25% טריטון X-100 ו-3.5% סרום רגיל (O/N ב-4 מעלות צלזיוס).
3. שטפו חלקים ב-PBS למשך 3 x 5 דקות.
4. דגירה עם נוגדנים מצומדים לפוספט אלקליין משניים למשך שעה אחת (1:100, 21 מעלות צלזיוס, מדולל ב-PBS).
5. שטפו את החלקים ב-PBS למשך 3 x 5 דקות.
   הערה: חשוב לשטוף את החלקים כראוי לאחר נוגדנים משניים כדי למזער כתמים ברקע.
6. דגרו חלקים בחושך עם כרוגן אדום קבוע נוזלי (15-20 דקות).
   הערה: הכינו את התמיסה לא יותר מ-30 דקות לפני השימוש.
7. שטפו חלקים ב-PBS למשך 3 x 5 דקות.
8. לבסוף, צבעו את הגרעינים ב-4-6-diamidino-2-phenylindole (DAPI; 1:500, מדולל ב-PBS) לפני החלקת הכיסוי. אחסן את השקופיות במקרר למשך 24-48 שעות לפני מיקרוסקופיה.

3. מיקרוסקופיה קונפוקלית

הערה: להערכה כמותית (ראה להלן), בחר אסטרוציט עם גרעין מוכתם DAPI הנראה בבירור עם מינימום ענפים חופפים כדי להפחית את הסיכון לטעויות. הפקת תמונות Z-Stack גוזלת זמן. היו סבלניים ואל תפסיקו במהלך העיבוד. מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי זקוף משמש ליצירת תמונות תלת מימד של אסטרוציטים.

1. שים את השקופית על במת המיקרוסקופ ובחר את המטרה 63X.
2. פתח את תוכנת ההדמיה ולחץ על התחל מערכת. לחץ על הכרטיסייה אתר. עבור אל הקצה ובחר GFP כדי לכוונן את האור המתאים.
3. פתח את התריס כדי להחזיר אור. מצא את אקדח הרפלקטור בצד ימין של התריס ובחר את הצבע שאמור להשתקף על ידי אסטרוציטים (ירוק, אדום או סגול); צבע אדום (FSet20 wf) שימש כאן.
   הערה: אל תשכח למקד את התמונה ישירות בעין המיקרוסקופ.
4. כדי למצוא את המיקוד הטוב ביותר, לחץ על הכל סגור, הכנס את סיכת המיקרוסקופ למצב מסך ולחץ על הכרטיסייה רכישה.
5. לחץ על הגדרה חכמה תחת הכרטיסייה רכישה; נפתח חלון. בחר את הפלואורופור המתאים (כלומר DAPI ו-Alexa Fluor 555, בפרויקט הנוכחי) מהרשימה. הצבע נבחר אוטומטית.
6. לחץ על האות הטוב ביותר והחל, ולאחר מכן לחץ על הגדר חשיפה; לאחר מכן המחשב יגדיר אוטומטית את פרמטרי החשיפה.
7. למיטוב התמונה, עבור לחלון ערוצים. בטל את הסימון של Track2, סמן את Track1 ולחץ על Live. התמקד בתמונה במידת הצורך.
8. בחלון הערוצים התאם את המקשים הבאים; לחץ על 1AU כדי לבצע אופטימיזציה אוטומטית של חור הסיכה. חשוב מאוד לבצע שלב זה, אחרת התמונות הקונפוקליות לא יהיו אופטימליות. כוונן את הרווח כך שתהיה העוצמה הטובה ביותר (שמור על הגדרה זו מתחת ל-800 כדי להפחית רעש נוסף). לבסוף, הגדר את הרווח הדיגיטלי בין 2 ל-3.
9. בטל את הסימון של רצועה 1, לחץ על רצועה 2 וחזור על שלב 3.8 עבור רצועה 2. לאחר מכן הפסיקו את השידור החי.
10. עבור אל חלון מצב רכישה. שפר את התמונה על ידי אופטימיזציה של גודל המסגרת והממוצע. על מנת לשנות את גודל המסגרת, עבור אל X*Y ובחר 1,024 x 1,024. בחר מהירות איטית כדי ליצור תמונה טובה יותר.
11. עבור אל חישוב ממוצע ובחר מספר ≥4. ערך ממוצע זה מציין את מספר הסריקות שיחושב בממוצע כדי לייצר את התמונה הנרכשת. כעת, לחץ על כפתור הצמד ושמור את התמונה הדו-ממדית שצולמה.
12. עבור הדמיה תלת מימדית, סמן את פריט Z-Stack תחת הגדרה חכמה, מה שגורם לחלון Z-Stack להיפתח.
13. הגדר את המיקום הראשון והאחרון עבור Z-Stack, כלומר את עומק התא. ראשית, לחץ על שידור חי. לאחר מכן השתמשו בכונן המיקוד של המיקרוסקופ כדי להתמקד במיקום העליון ביותר של האסטרוציט ברקמה, היכן שה-Z-Stack אמור להתחיל. לחץ על קבע תחילה. לאחר מכן, התמקדו למטה למיקום הנמוך ביותר של האסטרוציט ברקמה, שם יש לעצור את סריקת Z-Stack. לחץ על קבע אחרון. לאחר מכן הפסיקו את השידור החי.
14. בחר את המרווח; 1.01 מיקרומטר משמש במחקר הנוכחי; בחירת מרווח יכולה להיעשות על ידי לחיצה על אופטימלי כדי להגדיר את מספר הפרוסות.
15. לחץ על התחל ניסוי. שמור את התמונות לאחר השלמת הסריקה. תמונה זו תשמש למדידה של הפרמטרים הבאים: שטח הפנים והנפח של טריטוריית האסטרוציטים, כמו גם האסטרוציטים כולם, כולל ענפים, גוף התא והגרעין.

Materials