הדמיית ביולומינסנציה in vivo של תאי אב עצביים אנושיים במוח עכבר

כל ההליכים הכוללים מודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ומועצת הביקורת הווטרינרית של JoVE.

הדמיה in vivo

1. הכנת luciferin
   1. להפשיר מלח אשלגן D-luciferin בטמפרטורת החדר (RT) ולהכין תמיסת מלאי טרייה של D-luciferin ב-30 מ"ג/מ"ל ב-PBS.
   2. עקר את תמיסת המלאי באמצעות מסנן מזרק של 0.22 מיקרומטר.
      הערה: מומלץ להשתמש מיד בתמיסת העבודה. במידת הצורך ניתן לאחסן לוציפרין מומס בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס. עם זאת, אחסון ממושך עלול לגרום לירידה באות. לוציפרין הוא מגיב רגיש לאור; הרחק אותו מאור ישיר במידת האפשר. ניתן לשקול גם מצעים חלופיים, למשל, cycluc, כדי לשפר את מגבלת הרזולוציה.
2. הדמיה
   1. הגדרה ראשונית
      הערה: הדמיית ביולומינסנציה בוצעה באמצעות מערכת הדמיה in vivo (ראה טבלת החומרים) המורכבת מתא חשוך ומצלמת התקן מקורר (CCD).
      1. לחץ פעמיים על סמל התוכנה Living Image ובחר מזהה משתמש מהרשימה הנפתחת.
      2. לחץ על Initialize בלוח הבקרה שמופיע. לאחר השלמת תהליך האתחול, תיבת הטמפרטורה בלוח הבקרה תהפוך לירוקה.
      3. בלוח הבקרה, סמן את התיבות זוהר וצילום ובחר חשיפה אוטומטית (~60 שניות). בחר שדה ראייה (D/12.5 ס"מ נבחר לפרוטוקול זה). הזן את גובה הנושא (1.5 ס"מ) ובחר באפשרות השתמש במיקוד גובה הנושא. הגדר ידנית את הפרמטרים הבאים: binning גדול, f/2, מסנן עירור חסום ומסנן פליטה פתוח.
   2. קבעו את כמות ההזרקה של D-לוציפרין ב-300 מ"ג/ק"ג משקל גוף.
      הערה: המינון המומלץ הסטנדרטי הוא 150 מ"ג/ק"ג D-לוציפרין. הליך זה הותאם על פי פרוטוקול המדווח על רגישות גבוהה יותר באמצעות 300 מ"ג/ק"ג.
   3. יש להזריק את הלוציפרין תוך צפקית (i.p.).
      הערה: אם בעל החיים זקוק להרדמה לפני ההזרקה, שים לב שזה עלול להאריך את זמן הביטוי השיא של לוציפראז.
   4. המתן 5 דקות, ולאחר מכן הרדם בעלי חיים עם אספקה רציפה של איזופלורן (4.5% בשלב האינדוקציה ו-1.5-2% בשלב התחזוקה במהלך הליך ההדמיה).
   5. מרחו חומר סיכה עיניים על העיניים, ולאחר מכן גלחו את בעלי החיים הרדומים באזור הראש באמצעות מכונת גילוח שיער קונבנציונלית. הנח את החיות בתא ההדמיה והתחל לצלם 15 דקות לאחר הזרקת הלוציפרין על ידי לחיצה על Acquire בלוח הבקרה.