הדמיית ביולומינסנציה in vivo של תאי אב עצביים אנושיים במוח עכבר

תקציר

מקור: Weber, R. Z., et al., Intracerebral Transplantation and In vivo Bioluminescence Tracking of Human Neural Prognitor Cells in the Mouse Brain. J. Vis. Exp. (2022)

סרטון זה מדגים את השיטה להדמיית ביולומינסנציה in vivo של תאי אב עצביים אנושיים מהונדסים גנטית המוזרקים למוח עכבר. התהליך כולל הזרקת לוציפרין, הכנת הדמיה וזיהוי אותות ביולומינסנט מהתאים המושתלים באתר ההזרקה.

פרוטוקול

כל ההליכים הכוללים מודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ומועצת הביקורת הווטרינרית של JoVE.

הדמיה in vivo

1. הכנת luciferin
   1. להפשיר מלח אשלגן D-luciferin בטמפרטורת החדר (RT) ולהכין תמיסת מלאי טרייה של D-luciferin ב-30 מ"ג/מ"ל ב-PBS.
   2. עקר את תמיסת המלאי באמצעות מסנן מזרק של 0.22 מיקרומטר.
      הערה: מומלץ להשתמש מיד בתמיסת העבודה. במידת הצורך ניתן לאחסן לוציפרין מומס בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס. עם זאת, אחסון ממושך עלול לגרום לירידה באות. לוציפרין הוא מגיב רגיש לאור; הרחק אותו מאור ישיר במידת האפשר. ניתן לשקול גם מצעים חלופיים, למשל, cycluc, כדי לשפר את מגבלת הרזולוציה.
2. הדמיה
   1. הגדרה ראשונית
      הערה: הדמיית ביולומינסנציה בוצעה באמצעות מערכת הדמיה in vivo (ראה טבלת החומרים) המורכבת מתא חשוך ומצלמת התקן מקורר (CCD).
      1. לחץ פעמיים על סמל התוכנה Living Image ובחר מזהה משתמש מהרשימה הנפתחת.
      2. לחץ על Initialize בלוח הבקרה שמופיע. לאחר השלמת תהליך האתחול, תיבת הטמפרטורה בלוח הבקרה תהפוך לירוקה.
      3. בלוח הבקרה, סמן את התיבות זוהר וצילום ובחר חשיפה אוטומטית (~60 שניות). בחר שדה ראייה (D/12.5 ס"מ נבחר לפרוטוקול זה). הזן את גובה הנושא (1.5 ס"מ) ובחר באפשרות השתמש במיקוד גובה הנושא. הגדר ידנית את הפרמטרים הבאים: binning גדול, f/2, מסנן עירור חסום ומסנן פליטה פתוח.
   2. קבעו את כמות ההזרקה של D-לוציפרין ב-300 מ"ג/ק"ג משקל גוף.
      הערה: המינון המומלץ הסטנדרטי הוא 150 מ"ג/ק"ג D-לוציפרין. הליך זה הותאם על פי פרוטוקול המדווח על רגישות גבוהה יותר באמצעות 300 מ"ג/ק"ג.
   3. יש להזריק את הלוציפרין תוך צפקית (i.p.).
      הערה: אם בעל החיים זקוק להרדמה לפני ההזרקה, שים לב שזה עלול להאריך את זמן הביטוי השיא של לוציפראז.
   4. המתן 5 דקות, ולאחר מכן הרדם בעלי חיים עם אספקה רציפה של איזופלורן (4.5% בשלב האינדוקציה ו-1.5-2% בשלב התחזוקה במהלך הליך ההדמיה).
   5. מרחו חומר סיכה עיניים על העיניים, ולאחר מכן גלחו את בעלי החיים הרדומים באזור הראש באמצעות מכונת גילוח שיער קונבנציונלית. הנח את החיות בתא ההדמיה והתחל לצלם 15 דקות לאחר הזרקת הלוציפרין על ידי לחיצה על Acquire בלוח הבקרה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
חומרים מתכלים
ציוד
כרית			מוצר לבחירה
מערכת הדמיה In-Vivo (IVIS Lumina III עם חבילת תוכנה Living Imaging 4.2)	Perkin Elmer	CLS136334
Isoflurane וופורייזר	Provet AG	330724
תרופות וריאגנטים
מלח אשלגן	D-לוציפריןפרקין אלמר	122799
אתנול; 70%			מוצר לבחירה
איזופלורן (איזופלואורן (1-כלור-2,2,2-טריפלואוראתיל-דיפלואורומתילטר) 99.9%)	Provet AG	כל התרופות סופקו על ידי בית המרקחת הקנטונלי, ציריך, שוויץ
חומר סיכה אופטלמי (רטינול פלמיטט: 15,000 UI)	Bausch & Lomb Swiss AG	כל התרופות סופקו על ידי בית המרקחת הקנטונלי, ציריך, שוויץ

מסנן מזרק ; TPP 99722 של 0.22 מיקרומטר חימום