ספקטרוסקופיה קוהרנטית נגד סטוקס ראמאן להדמיית נוירונים מיאליניים ברקמת מוח של עכבר

תקציר

מקור: McCullagh, E. A., et al. יישום קוהרנטי של ספקטרוסקופיית רמאן אנטי-סטוקס (CARS) להדמיית מיאלינציה בפרוסות מוח. J. Vis. Exp. (2022)

הסרטון מדגים הדמיה פלואורסצנטית וספקטרוסקופיה קוהרנטית של רמאן אנטי-סטוקס (CARS) כדי להמחיש ארכיטקטורה עצבית ברקמת מוח של מכרסמים. צביעת Nissl מסמנת גופי תאים על ידי קשירה ל-RNA ריבוזומלי, בעוד שהדמיית CARS מכוונת למיאלין עשיר בשומנים באמצעות אותות המושרים בלייזר. שכבת תמונות הקרינה וה-CARS מספקת תצוגה מפורטת של גופי תאים ואקסונים מיאליניים.

פרוטוקול

כל ההליכים הכוללים דגימות של בעלי חיים נבדקו ואושרו על ידי ועדת הביקורת האתית המתאימה לבעלי חיים.

1. מכתים

1. חלקים צפים ללא כתמים עבור Nissl, להדמיית גופי תאים (1:100), במדיית נוגדנים (מדיה AB: 0.1 M מאגר פוספט (PB: 50 מ"מ KH2PO4, 150 מ"מ Na2HPO4), 150 מ"מ NaCl, 3 מ"מ Triton-X, 1% אלבומין בסרום בקר (BSA)) למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר על שייקר מעבדה סטנדרטי.
   1. הגן על חלקים מפני אור באמצעות רדיד אלומיניום ו/או כיסוי. אורכי גל של 550 ננומטר ומטה תואמים להדמיית CARS (איור 1).
      הערה: בעוד שאיננו מצפים שלטריטון-X או ריאגנטים אחרים תהיה השפעה על הדמיית CARS של שומנים, ייתכן שיהיה צורך בבקרות נוספות עם מדיית נוגדנים ספציפית.
2. נקודת השהייה: אחסן חלקים צפים בחופשיות (כשהם מוגנים מפני אור) במי מלח עם חוצץ פוספט (PBS) עד להדמיה. לאחר החתך, דמיין חלקי מוח תוך שבועיים.

2. הדמיה

הערה: מערך הלייזר CARS מכיל לייזר סיבים המספק את השעון של 80 מגה-הרץ, ולייזר OPO (מתנד פרמטרי אופטי) עם טווח מתכוונן של 770-990 ננומטר עם קרן סטוקס קבועה ב-1031 ננומטר, הדרושים לאיסוף אות ה-CARS. יש צמצם אחד לשתי הקורות.

1. לפני הבאת דגימות למיקרוסקופ, הפעל וחמם את לייזר CARS למשך שעה אחת לפחות, יישר את לייזר ה-CARS, ואת קוהלר את אופטיקת המעבה ואת הסרעפת של המיקרוסקופ להדמיית CARS קדימה.הערה: שלב זה הוא קריטי לתפקוד תקין של מיקרוסקופיית CARS.
   1. ליישור מרחבי של שתי קרני הלייזר (משאבה וסטוקים), גש לשני ה-PSDs הפנימיים (גלאים רגישים למיקום) באמצעות ממשק המשתמש הגרפי של לייזר CARS (ממשק משתמש גרפי).
   2. השג יישור זמני על ידי שימוש בפונקציית ההשהיה בממשק המשתמש הלייזר CARS, שיכול לעזור לחפוף את הפולסים של שני הלייזרים (משאבה וסטוקים) בעלי פיזור שונה בגלל אורכי הגל השונים שלהם. לכן, גם החפיפה הזמנית וגם המרחבית של אלומות המשאבה והסטוקס נעשית עם קלט המשתמש דרך ממשק המשתמש הגרפי.
   3. כוונן את הפריסקופ החיצוני (שתי המראות האחרונות של ההגדרה) כדי למרכז את שני הלייזרים החופפים מרחבית על מראות ראש הסריקה של המיקרוסקופ.
   4. לזיהוי הטוב ביותר של CARS קדימה שאינו נסרק, ודא שהמעבה הוא Koehler-ed (כלומר המעבה מרוכז וממוקד על הסרעפת כדי להשיג תאורה אחידה)
2. עבור הדמיה קונפוקלית אימונופלואורסצנטית והדמיית CARS, התאימו את לייזר ה-CARS, עם גלאים לא סרוקים (NDDs) קדמיים ו-epi CARS, על ידי שילוב מיקרוסקופ קונפוקלי המצויד בלייזרים גלויים להדמיה פלואורסצנטית (איור 2).
3. מניחים חלקים בכלי תרבית עם כיסוי (למיקרוסקופיה הפוכה), PBS כדי למנוע התייבשות של הרקמה, ומשקולת זכוכית כדי לשמור על הרקמה ליד הכיסוי.
4. קחו ערימות z או תמונות בודדות עם מטרת מים מתוקנת אינפרא אדום 60X, 1.2 צמצם מספרי (NA), המשמשת לאיסוף אות ה-CARS בכיוון ה-epi ודרך מעבה NA 0.55 בכיוון קדימה להדמיית אזורי מוח כגון הגרעין המדיאלי של גוף הטרפז (MNTB).
   1. צלם את תמונות ה-CARS בכ-600 mW משאבה/בדיקה ו-300 mW Stokes, באמצעות ממשק המשתמש הלייזר של CARS. ערכי הספק לייזר אלה נמדדים באופן פנימי על ידי המערכת. הספקי שני הלייזרים במיקום הדגימה הם פחות מ-25 mW ובטוחים לדגימת הרקמה.
   2. חופפים את המשאבה ואת קורות סטוקס מרחבית וזמנית. כוונן את ה-OPO ל-797.2 ננומטר. זה מניב אורך גל CARS של 650 ננומטר. בגלל רמת האנרגיה הגבוהה יותר, החזרה המתקבלת למצב הקרקע היא אנטי-סטוקס (כחול מוסט) לעירור.
   3. ללכוד את אות ה-CARS בגלאי epi או קדימה שאינם סרוקים באמצעות מסנני פס פס (640-680 ננומטר) ואחריו זיהוי רציף של תווית האימונופלואורסצנציה (במקרה זה מסומן פלואורסצנטי Nissl). הערה: סמן הסומה העצבי של Nissl אינו נתפס במסנן הפס CARS 640-680 ננומטר, מה שמאפשר שילוב של פלואורסצנטיות והדמיית CARS בתמונות המוצגות להלן.
   4. ה-CARS והפלואורסצנציה אינם חולקים PMT. השתמש בהגדרות אלה לאות שומנים אופטימלי כדי לדמות באופן סלקטיבי מיאלינציה באזור המוח. זהירות: מגן על המשתמש מפני קרן הלייזר
5. שמור את התמונות כקבצי .oib, אותם ניתן לייבא לתוכנית ניתוח תמונה עבור כימות נוסף (איור 3).

תוצאות

איור 1: ניתן לשלב הדמיית CARS עם הדמיה אימונו-פלואורסצנטית. הגרפים מראים שהדמיית CARS מתרחשת בספקטרום האותות האדומים של 660/640 ננומטר. אורך גל זה רחוק מספיק מהתחום הירוק, הכחול או ה-UV, מה שמאפשר שילוב של אות CARS עם אימונופלואורסצנציה בטוו...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
Staining:
AB מדיה:			1n 1,000 מ"ל של Millipore H2O
פוספט חוצץ (PB):
אשלגן פוספט מונובייס	סיגמא	P5655
נתרן פוסוהאט דו-בסיסי	סיגמא	S7907
BSA (אלבומין סרום בקר)	סיגמא מדעי החיים	A2153-100 גרם
נתרן כלורי	פישר כימיקל	s271-1
טריטון X-100	סיגמא - אולדריץ'	x100-500 מ"ל
ניסל 435/455	Invitrogen	N21479
מכוניות:
מסנן פס פס לייזר APE picoemerald	Angewandte Physik & Elektronik GmbH
(420-520 ננומטר)	Chroma Technology	HQ470/100m-2P
מסנן פס פס (500-530 ננומטר)	Chroma Technology	HQ515/30m-2P
פס מסננים (640-680 ננומטר)	Chroma Technology	HQ660 / 40m-2P
מיקרוסקופ קונפוקלי	אולימפוס	FV1000
חתוך העברת צינור	פישר	13-711-7M
מעבר ארוך דיכרואי 565 ננומטר	טכנולוגיית כרומה	565dcxr
מעבר ארוך דיכרואי 585 ננומטר	טכנולוגיית כרומה	585dcxr
קיצור דרך דיכרואי 750 ננומטר	Chroma Technology	T750spxrxt
צלחת תרבות תחתונה מזכוכית	MatTek	P35G-0-10-C
משקל זכוכית (10 מ"מ x 10 מ"מ מוט בורו)	Allen Scientific Glass Inc
מסנן פליטת קצר רב-פוטוני 680 ננומטר	Chroma Technology	ET680sp-2p8
PBS

פס