הדמיית דינמיקת סידן בתאי שיער בקו הרוחב של דג זברה זחל

תקציר

מקור: Lukasz, D., et al. הדמיית סידן in vivo של תאי שיער בקו הרוחב בדג זברה זחל. J. Vis. Exp. (2018)

סרטון זה מדגים הדמיה חיה של זרם סידן בתאי השיער בקו הצדדי של זחל דג זברה טרנסגני משותק באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי. גירוי מכני של צרורות שיער באמצעות פולסים נוזליים גורם לכניסת סידן דרך תעלות מכניות ותעלות מגודרות מתח, אשר מוצגות בזמן אמת באמצעות מחווני פלואורסצנטיות. השיטה מדגישה את הדינמיקה של סידן אפיקלי ובסיסי בתאי שיער נוירומסטים, ומבהירה את תפקידם בזיהוי תנועת מים.

פרוטוקול

כל ההליכים הכוללים מודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ומועצת הביקורת הווטרינרית של JoVE.

1. הצמדה וקיבוע של זחל לחדר הדמיה
   1. רחץ זחל Tg(myo6b:GCaMP6s-caax) בכ-1 מ"ל של מאגר עוברי (E3) המכיל 0.04% MS-222 למשך 1-2 דקות על פני השטח של מעטפת הסיליקון של תא ההדמיה עד שהזחל הופך לחסר תנועה או לא מגיב למגע.
      1. תחת סטריאומיקרוסקופ, מקם את הזחל במרכז תא הזלוף כך שהוא ישכב שטוח על צדו כנגד מעטפת הסיליקון.
         הערה: לעקביות, הרכיבו תמיד זחלים באותו צד (למשל, צד ימין כלפי מטה, צד שמאל כלפי מעלה) (איור 2B1).
   2. בעזרת מלקחיים עדינים, הביאו סיכת ראש 0.035 מ"מ בניצב לזחל ולתא. הכנס את סיכת הראש בין העין לשלפוחית האוטית ולמטה לתוך האנקפסולנט (איורים 1B1 ו-1B2). השתמש בסט שני של מלקחיים כדי לייצב את הזחל לאורך הצד הגבי או הגחוני שלו בזמן ההצמדה. ודא שהחלק האופקי של הסיכה יוצר קשר עם הזחל ואינו לוחץ עד הסוף לתוך המעטפת. זווית את הסיכה לכיוון הגחון (איור 1B1) או הצביעה מעט לכיוון החלק הקדמי של הדג כדי להימנע מהפרעה להזרקת הלב ולהדמיית תאי השיער שלאחר מכן.
      1. בעזרת המלקחיים, הכנס סיכת זנב של 0.025 מ"מ לתוך החריץ קרוב ככל האפשר לקצה הזנב (איור 1B1).
         הערה: היזהר להימנע ממתיחת הזחל. הצמד את הזחל שטוח. העיניים צריכות להיות מונחות על גבי העיניים (איור 2B1). זה חשוב מאוד להקלה על הזרקת הלב (איור 1B2-B2', שלב 3), להקל על מישור הדמיה רצוי (איור 1B1-B2', שלבים 5), ולכמת את עוצמת הגירוי של סילון נוזל (איור 3A3, שלב 4).
2. הזרקת α-בונגרוטוקסין לחלל הלב לשיתוק הזחלים

הערה: יש ללבוש כפפות בעת הטיפול ב-α-bungarotoxin.

1. צנטריפוגה את ה-α-bungarotoxin aliquot זמן קצר לפני השימוש כדי למנוע סתימה של מחט הזרקת הלב.
   1. מילוי חוזר של 3 מיקרוליטר של תמיסת α-bungarotoxin למחט הזרקת לב באמצעות קצה פיפטה לטעינת ג'ל. טען את התמיסה באופן שווה לקצה ללא בועות.
   2. הכנס את מחט הזרקת הלב למחזיק פיפטה המחובר למיקרומניפולטור ידני. תחת סטריאומיקרוסקופ, מקם את המחט כך שהיא מיושרת בניצב לציר ה-AP של הזחלים המוצמדים והמורדמים, כשהיא מצביעה כלפי מטה בזווית של ~30°.
   3. חבר את מחזיק הפיפטה למזרק הלחץ. החל את ההגדרות המוצעות הבאות: Pinjection = 100 hPa, tinjection = 0.5 שניות ו- Pcompensation = 5 hPa. הזריק בולוס לתמיסה כדי לבדוק אם קצה המחט הוא פטנט.
   4. חפש נשיפה קטנה של התמיסה האדומה (מפנול אדום) כדי להשאיר את קצה המחט. אם לא נראה צבע אדום, גרדו בעדינות רבה את קצה המחט כנגד קצה הסיכה ונסו שוב עד שהמחט תהיה פטנט. לחלופין, משוך מחט עם פתח קצה גדול יותר.
2. קדמו את המחט לכיוון הלב עד שהיא נוגעת בעור שמחוץ ללב (איור 1B2). לחצו את המחט לתוך הזחל וחפשו שקע של תא הפיגמנט על העור מול הלב כדי לוודא שהמחט ממוקמת במישור הנכון ביחס לזחל (איור 1B2').
   1. קדם את המחט הלאה עד שהיא חודרת את העור ונכנסת לחלל הלב. משוך מעט את המחט לאחור. יש להזריק בולוס של α-בונגרוטוקסין לחלל הלב. חפשו ניפוח של חלל הלב או צבע אדום שנכנס לחלל
.
3. שטפו בעדינות את הזחל 3 פעמים עם 1 מ"ל של חיץ עצבי (NB) כדי להסיר שאריות MS-222. לעולם אל תסיר את כל הנוזלים. שמור על הזחל בכ-1 מ"ל של NB על תא הזלוף.
   הערה: ודא שפעימות הלב וזרימת הדם של הזחל נשארות חזקות לאחר הצמדה והזרקת לב ולאורך כל ניסוי ההדמיה.
4. הכנת מיקרוסקופ והגדרת סילון נוזל
   1. הרכיב מיקרוסקופ קונפוקלי זקוף באמצעות הרכיבים המתוארים בטבלת החומרים: מיקרוסקופ קונפוקלי עם לייזר 488 ננומטר ומסננים מתאימים, תוכנת מיקרוסקופ לבקרה ותיאום הדמיה וגירוי, מטרת אוויר פי 10, מטרת מים פי 60, סורק אובייקטיבי piezo-Z (עבור ערימות z), מצלמה מהירה, תא עגול מתאם, במה ממונעת ומתאם הכנסת במה.
   2. הרכיבו את סילון הנוזל המורכב משלושה מרכיבים עיקריים: משאבת ואקום ולחץ, מהדק לחץ מהיר ושלב ראש (מתואר גם בטבלת החומרים). השתמש בלחץ המהיר clamp כדי לשלוט בתזמון ומשך הלחץ או פריקת הוואקום משלב הראשים ולתוך פיפטת סילון הנוזל.
      1. חבר את הפלט של שלב הראש למחזיק פיפטת סילון נוזל באמצעות צינורות סיליקון בעלי קירות עבים.
5. יישור הזחל וסילון הנוזל

הערה: ישנם 3 מישורים מעניינים בתוך כל תורן עצבי: (1) קצות צרורות השיער (איור 3A3: הקינוציליה, המשמשת למדידת עוצמת הגירוי); (2) מישור הטרנסדוקציה המכאנית של צרור השיער (MET) (איור 2B1-B1': הבסיס של צרורות השיער האפיקליים שבהם מתגלים אותות סידן תלויי ערוץ MET); ו-(3) המישור הסינפטי (איור 2B2-B2': שבו אותות סידן פרה-סינפטיים מזוהים בבסיס תא השערה). מישורים אלה מתוארים באיור 2A.

1. מילוי חוזר של 10 מיקרוליטר של NB למחט סילון נוזלים שבורה כהלכה באמצעות קצה טעינת ג'ל. טען את התמיסה באופן שווה לקצה ללא בועות. הכנס את המחט למחזיק הפיפטה המחובר למיקרומניפולטור הממונע.
2. הנח את תא הזלוף לתוך מתאם תא עגול על המיקרוסקופtagה. הערה: לעקביות, מקם תמיד את הזחל באותו כיוון (למשל, החדר המכיל את הזחל עם החלק האחורי שלו לכיוון סילון הנוזל והצד הגחוני פונה לכיוון הנסיין).
   1. הזז את השלב הממונע כך שהזחל יהיה במרכז שדה הראייה. סובב את מתאם התא העגול כך שהציר הקדמי-אחורי (A-P) של הזחל מיושר בערך עם המסלול של מחט סילון הנוזל.
   2. באמצעות אור מועבר וניגודיות הפרעות דיפרנציאליות (DIC), הביאו את הזחל למיקוד ומרכזו אותו תחת המטרה פי 10. העלה את יעד פי 10.
3. בעזרת המיקרומניפולטור הממונע, הורידו את מחט סילון הנוזל למרכז שדה הראייה כך שהיא מוארת על ידי האור המועבר ובקושי נוגעת בתמיסת ה-NB.
   1. הורד את המטרה פי 10. התמקדו בזחל כדי לאשר את מיקומו. התמקד למעלה כדי למצוא את מחט סילון הנוזל. הזז את מחט סילון הנוזל עם המיקרומניפולטור בצירי ה-x וה-y עד שהיא נמצאת במצב מקביל לצד הגבי של הדג.
   2. התמקדו בחזרה בזחל. הורד את המחט בציר ה-z. מקמו את המחט לאורך הצד הגבי של הדג ובמרחק של ~1 מילימטר מהגוף (איור 3A1).
   3. הזז בזהירות את מתאם התא העגול (במידת הצורך) כדי להבטיח שמחט סילון הנוזל מיושרת לאורך קו האמצע של הזחל (איור 3A1).
   4. הזז את הבמה הממונעת כדי למקם את הנוירומסט המעניין במרכז שדה הראייה. שמור את קצה מחט סילון הנוזל לאורך הצד הגבי של הדג. אל תיגע בקצה מחט סילון הנוזל לזחל או למשטח החדר.
4. עבור למטרת המים פי 60. ודא שהמטרה שקועה בפתרון NB. השתמש במיקוד העדין כדי לאתר נוירומסט באמצעות אור מועבר ואופטיקה של DIC.
   הערה: הגדרה זו נועדה לעורר נוירומסטים לאורך הקו הצדדי האחורי הראשוני. תאי שיער בתוך נוירומסטים אלה מגיבים לזרימת נוזלים מכוונת קדמית או אחורית.
   1. מקם את מחט סילון הנוזל עם המיקרומניפולטור כך שהיא תהיה במרחק של 100 מיקרומטר מהקצה החיצוני של הנוירומסט (איור 3A2).
      הערה: בחר נוירו-תרנים המציעים תצוגות ברורות מלמעלה למטה (איורים 2B1'-B2' ואיור 3A3) במקום תצוגות בזווית צדדית (איור 2C1-C2). תצוגה ברורה מלמעלה למטה מאפשרת הדמיה בו-זמנית של כל צרורות השיער האפיקליים במישור אופטי יחיד או הדמיה של אזורים סינפטיים בפחות מישורים אופטיים (איור 3A3).
   2. התמקדו עד לקצות צרורות השיער האפיקליים (קינוציליה) (איור 1A, איורים 3A2 ו-3A3). החלק התחתון של מחט סילון הנוזל צריך להיות ממוקד במישור זה.
5. הגדר את מהדק הלחץ המהיר ממצב ידני למצב חיצוני כדי לקבל קלט מתוכנת ההדמיה.
   1. אפס את מהדק הלחץ המהיר על ידי לחיצה על כפתור "אפס". השתמש בכפתור נקודת ההגדרה כדי להגדיר את לחץ המנוחה מעט חיובי (~2 מ"מ כספית). אשר את תפוקת המנוחה של הלחץ המהיר clamp באמצעות מד לחץ פאונד לאינץ' מרובע (PSI) המחובר לפלט שלב הראש.
      הערה: הגדר לחץ חיובי מעט במנוחה כדי למנוע ספיגה הדרגתית של נוזל למחט סילון הנוזל לאורך זמן. אם נוזל נכנס לצינור המחובר לסילון הנוזל ומגיע לשלב הראש, הוא עלול לפגוע בציוד.
   2. קבע את הלחץ הדרוש כדי לעורר את צרורות השיער. השתמש בכניסה של 0.125 ו-0.25 וולט (6.25 ו-12.5 מ"מ כספית) למשך 200-500 אלפיות השנייה כדי להחיל גירוי בדיקה (איור 3A3-A3'').
      הערה: מהדק הלחץ המהיר ממיר כניסת מתח (מתוכנה או מהתקנים אחרים המתחברים ליציאת כידון ניל-קונסלמן (BNC) ביציאת הפקודה של מהדק הלחץ המהיר) ללחץ המשוחרר משלב הראש, ובסופו של דבר, מחט סילון הנוזל (1.0 V = 50 מ"מ כספית, בעוד -1.0 V = -50 מ"מ כספית). בתצורה זו (ראה שלב 4.2) לחץ חיובי (דחיפה) מסיט את צרורות השיער לכיוון הקדמי, ולחץ שלילי (משיכה) מסיט את צרורות השיער לכיוון האחורי.
   3. באמצעות אור מועבר ואופטיקה של DIC יחד עם סרגל קנה מידה, מדוד את מרחק הסטייה על ידי גירויים של 6.25 ו-12.5 מ"מ כספית של קצות צרורות השיער, הקינוציליה (איור 2A ואיורים 3A3-3''). בחר לחץ שמזיז את הצרורות (כיחידה מלוכדת אחת) למרחק של כ-5 מיקרומטר (איור 3A3''). ודא שקצות הקינוציליה יישארו בפוקוס כל הזמן.
   4. הזיזו את סילון הנוזל ±-25 מיקרומטר לאורך ציר ה-A-P של הזחל כדי למצוא מרחק ולחץ שמסיטים את קצות הקינוציליה 5 מיקרומטר.
      הערה: שימוש ב-GCaMP6s בזחלים 3-7 ימים לאחר ההפריה (dpf), סטייה של 5 מיקרומטר אמורה להשיג אותות סידן של GCaMP6s קרוב לרוויה ולא אמורה לפגוע במבני צרורות שיער אפיקליים (איור 3A3''). ניתן להשתמש במרחקי תזוזה קטנים יותר כדי לספק גירויים לא רוויים (איור 3A3'). קשה להעריך מרחקי תזוזה >10 מיקרומטר (איור 3A3'") ויכולים להזיק לאורך זמן. רוויית האותות תלויה בגיל הנוירומסט (ובגובה הקינוציליאלי) כמו גם במחוון בו נעשה שימוש. בדוק את הסבלנות של מחט סילון הנוזל לכל כיוון (לחץ/דחיפה ואקום/משיכה) מעת לעת במהלך ההדמיה. מחטי סילון נוזלים נסתמות בקלות ומאבדות את סבלנות הוואקום, אך הן שומרות על סבלנות לחץ שיורי. השתמש באופטיקה של DIC ובגירוי בדיקה קצר לכל כיוון כדי לבדוק אם יש סבלנות של סילון נוזלים.
   5. מקד את הדגימה במישור העניין (למשל, בסיס צרורות השיער האפיקליים או בסיס תא השערה במישור הסינפטי; איור 2B1-B2').
6. נוהל רכישת הדמיה: רכישת מישור יחיד

הערה: כל ההדמיה המתוארת בפרוטוקול זה מתבצעת בטמפרטורת החדר (RT).

1. הגדר תוכנת הדמיה לרכישת הזרמה או רכישה רציפה של 80 פריימים עם לכידה כל 100 אלפיות השנייה כדי להשיג קצב פריימים של 10 הרץ.
2. הגדר הגבר, צמצם ועוצמת לייזר כדי לייעל את זיהוי האותות, אך הימנע מרוויה, פוטו-הלבנה ורעש. הגדרות לדוגמה עבור Opterra/SFC הן כדלקמן: הספק לייזר של 488 ננומטר: 50 (מישור MET צרור שיער), 75 (מישור סינפטי); חריץ 35 מיקרומטר; רווח = 2.7; רווח EM = 3900.
   הערה: החל 2 X binning אם האותות חלשים מדי או רועשים או שיש להם פוטוהלבנה מוגזמת. 2 X binning ישפר את זיהוי האותות במחיר של רזולוציה מרחבית.
3. בחר גירוי שיספק במהלך רכישת 80 פריימים (8 שניות) לאחר פריים 30, ב-3 שניות
   הערה: כמה גירויים לדוגמה הם כדלקמן: 200 אלפיות השנייה (+ או - 0.25 וולט) עד 2 שניות (+ או - 0.25 וולט) צעד בכיוון הקדמי או האחורי כדי לזהות את רגישות הכיוון של כל תא שערה; 2 שניות, גל מרובע של 5 הרץ (0.25 וולט עבור 200 אלפיות השנייה, -0.25 וולט עבור 200 אלפיות השנייה, חוזר על עצמו 5 פעמים) כדי לעורר את כל תאי השיער בו זמנית. לחץ חיובי (גירוי קדמי) יפעיל מחצית מתאי השיער. לחץ שלילי (גירוי אחורי) יפעיל את החצי השני של תאי השיער. ודא שתוכנת הגירוי או המכשיר מחזירים את מהדק הלחץ בחזרה ל-0 וולט לאחר סיום הגירוי.
4. למדוד תגובות סידן רגישות למכניקה. התמקדו בבסיס צרורות השיער האפיקליים (איורים 2A ו-2B1-B1') והתחילו ברכישת תמונה.
   הערה: אם הנוירומסט נראה בבירור מלמעלה למטה (איור 2B1-B1'), ניתן לדמות את כל צרורות השיער האפיקליים בו-זמנית במישור אחד.
5. למדוד תגובות סידן פרה-סינפטיות. התמקדו בבסיס תאי השיער (איורים 2A ו-2B2-B2') והתחילו ברכישת תמונה.
   הערה: אם מסתכלים על הנוירומסט בבירור מלמעלה למטה (איור 2B2-B2'), מישורי ההדמיה הפרה-סינפטיים של כל תאי השיער יכולים להיות נרכשים ב-2-3 מישורים שמפרידים 2 מיקרומטר זה מזה. ניתן להשתמש בדגים טרנסגניים Tg[myo6b:ribeye-mcherry] כדי לזהות ולאתר סרטים פרה-סינפטיים ואתרים של כניסת סידן.

תוצאות

איור 1: תא הדמיה, הרכבה של דג זברה והליכי הזרקת לב, ומחטים. (A) מוצג תא הדמיה עם זחל (מתוחם על ידי מלבן מקווקו) מוצמד למרכז על גבי מעטפת הסיליקון. (ב1) מוצג זחל של 5 dpf משותק על ידי שני סיכות. סיכת ראש גדולה ממוקמת בניצב לגו...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
α-Bungarotoxin	R&D Systems	2133	לשיתוק זחלים לפני הדמיה
תא הדמיה	Siskiyou	PC-R	פלטפורמה להרכבת זחלים להדמיה
מס' 1.5 כיסויים מרובעים, 22*22 מ"מ	VWR	48366-227	לאיטום תא הדמיה
גריז סיליקון בוואקום גבוה	פישר סיינטיפיק	14-635-5D	להדבקת כיסוי לתא הדמיה
ערכת מעטפת סיליקון שקופה 0.5 גרם דבקי	אלסוורת'	Dow Corning Sylgard, 184 SIL ELAST KIT 0.5 ק"ג	למילוי תא הדמיה ליצירת משטח להצמדת דגים
סטריאומיקרוסקופ	קרל זייס מיקרוסקופיה	Stemi 2000 עם תאורת אור משודרת	להארת חוטים, מלקחיים ומספריים לייצור סיכות
מלקחיים עדינים	Fine Science Tools	Dumont #5 (0.05 x 0.02 מ"מ) פריט מס' 11295-10	להכנת
סיכות מספריים עדינות	Cole-Palmer	5.5 אינץ', EW-10818-00	לחיתוך חוט tunsgten לייצור סיכות
חוט טונגסטן, 0.035 מ"מ	Goodfellow	W005131	לסיכות ראש לשיתוק זחלים
חוט טונגסטן, 0.025 מ"מ	ThermoFischer Scientific	AA10405-H4	לסיכות זנב לשיתוק זחלים
נימי זכוכית בורוסיליקט ללא נימה	Sutter Instrument Company	B 150-86-10	זכוכית למשיכה לתוך מחטי סילון נוזלים כדי לעורר תאי שיער
מלקחיים עדינים	כלי מדע עדינים	Dumont #5 (0.05 x 0.02 מ"מ) פריט מס' 11295-10	להצמדת זחלי
ג'ל טיפים לטעינה	Eppendorf	5242956003	למילוי חוזר של מחטי הזרקת לב
סטריאומיקרוסקופ	קרל זייס מיקרוסקופיה	Stemi 2000 עם תאורת אור משודרת	להארת זחלים במהלך הצמדה והזרקת לב
מחזיק נימי זכוכית/מחט	WPI	MPH315	להחזקת מחטי סילון נוזלים
מיקרומניפולטור ידני	Narishige	M-152	להחזקה ומיקום של מחזיק מחט להזרקת מעמד מגנטי α-bungarotoxin
	Narishige	GJ-1	להחזקת מיקרומניפולטור ידני להזרקת α-bungarotoxin
מזרק לחץ	Eppendorf	Femtojet 4x	כדי לספק מיקרוסקופ קונפוקלי α-bungarotoxin
	Bruker	שדה נסחף/מיקרוסקופ	קונפוקלי Opterraמיקרוסקופ קבוע וזקוף עם אופטיקה DIC ולייזר 488 ננומטר עם מסננים מתאימים
תוכנת מיקרוסקופ	Bruker	Prairieview 5.3	לתיאום ובקרה של המיקרוסקופ, לייזרים, שלב, piezo-z, מצלמות וסילון
נוזלים 10x אובייקט אוויר	ניקון	MRH00101	הגדלה נמוכה למיקום זחלים וסילון נוזלים
60x מטרת מים	ניקון	MRF07620	מטרת טבילה במים עם NA גבוה (1.0) ומרחק עבודה הולם (2.0 מ"מ)סורק
אובייקטיבי Piezo-Z עם בקר/דרייבר	Physik Intruments instruments/Bruker	01144210/UM-Z-PZ	רכישת z-stack במהירות גבוהה עם דיוק 0.025um
מצלמת EMCCD	QImaging	מצלמת EMCCD רולרה EM-C2	מצלמה עם גודל פיקסל קטן שיכולה לרכוש עד 100 פריימים לשנייה
מתאם	תא עגולSiskiyou	PC-A	להחזקה וסיבוב של תא הדמיה על במת המיקרוסקופ
שלב סיפון Z ממונע שלב	ZDN12MP מדעי קודם		שיכול להחזיק ולהזיז דגימה ומיקרומניפולטור עם מחט סילון נוזלים יחד
מתאם הכנסת שלב Z-deck	חנות מכונות	NIH מותאמת אישית	כדי להתאים את מתאם התא העגול ל-z-deck stage
מנגנון	סילון נוזליםמכשירים מדעיים ALA	HSPC-1 מהדק לחץ במהירות גבוהה עם PV-PUMP	לשליטה ואספקת גירוי סילון נוזל
Masterflex צינורות סיליקון מרפאים מי חמצן (1 רגל)	Cole-Palmer	Masterflex L/S 13, 96400-13	לחיבור מחזיק מחט סילון נוזל למשאבת לחץ
מיקרומניפולטור ממונע	Sutter Instrument Company	MP-225	להחזקה ומיקום של מחזיק מחט לנוזל
בקר מיקרומניפולטור	Sutter Instrument Company	MPC-200	לשליטה במניפולטור מחט סילון נוזל
טיפים לטעינת ג'ל	Eppendorf	5242956003	למילוי חוזר של מחטי סילון נוזלים
מחזיק נימי/מחט זכוכית	WPI	MPH315	להחזיק מחטי סילון נוזלים
לחץ	PSI Sper Scientific	840081	למדידה פלט מהדק לחץ
Prism7	Graphpad	Prism7	תוכנה להתוויית שינויי עוצמה GCaMP6
FIJI	Schindelin, et., al.34	https://fiji.sc/ תוכנה לעיבוד תמונות ויצירת מפות אותות מרחביות-זמניות Turboreg Plugin Thévenaz et., al.29
		http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/	תוסף לרישום רצפי תמונות GCaMP6 בתוסף FIJI
StackReg	Thévenaz et., al.29	http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/	Plugin לרישום רצפי תמונות GCaMP6 ב-FIJI
Times Series Analyzer V3 Plugin	Balaji J 2007, המחלקה לנוירוביולוגיה, UCLA	a href='https://imagej.nih.gov/ij/plugins/time-series.html'>תוסף https://imagej.nih.gov/ij/plugins/time-series.html	ליצירת החזר ROI מרובה למדידת שינויי עוצמת GCaMP6

מיקרוסקופ סילון מד<