$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
כל ההליכים הכוללים דגימות של בעלי חיים נבדקו ואושרו על ידי ועדת הביקורת האתית המתאימה לבעלי חיים.
1. הכנה
1. הקניטו כל שריר בצרורות סיבים קטנים ברוחב של כ-1 מ"מ באמצעות שני מלקחיים משוננים עדינים.
הערה: חיוני לתפעל את השרירים בעדינות רבה עם המלקחיים, ללא כוח מוגזם, כדי למנוע נזק לרקמות במהלך הקנטה.
1. לפרק את שריר השוקה הקדמי (TA) ל-3 או 4 צרורות בהתאם לגודלו.
2. עבור גסטרוקנמיוס (GA), הפרד את החלקים המדיאליים והצדדיים של השריר ולאחר מכן פרק כל חלק ל-4-5 צרורות בהתאם לגודלם.
2. צביעה חיסונית
1. המשך עם חדירת סיבי שריר: העבירו צרורות שרירים לצלחות של 24 בארות המכילות 1% (v/v) Triton X-100 בתמיסת מלח עם פוספט (PBS) ושמרו אותם תחת תסיסה עדינה (50 סל"ד) למשך שעה אחת ב-RT או 5 שעות ב-4 מעלות צלזיוס.
הערה: פצלו את צרורות השרירים בין שתי צלחות כדי להמשיך עם צביעה חיסונית נפרדת וכדי למזער את הסיכון לבלבול נוגדנים. אין לפצל אותם ליותר משתי בארות (1 באר/צלחת); אחרת, המספר (N) של צמתים עצביים-שריריים (NMJs) המייצגים את מצבם הכללי בשריר המנותח עשוי להיות לא מספיק.
2. שטפו את הדגימות 3 פעמים למשך 5 דקות עם PBS ב-RT ודגרו אותן עם תמיסת חסימה המורכבת מ-4% אלבומין בסרום בקר (BSA) ב-PBS/Triton X-100 1% למשך 4 שעות ב-4 מעלות צלזיוס, תחת תסיסה עדינה (50 סל"ד).
הערה: אין להשתמש במשאבת שאיפה במהלך שלבי הכביסה אלא לשאוב את התמיסה באופן ידני עם פיפטה של 200 מיקרוליטר וטיפים בגודל קטן (ההפניה מצוינת בטבלת החומרים).
3. דגרו את הדגימות למשך הלילה (O/N) ב-4 מעלות צלזיוס תחת תסיסה עדינה (50 סל"ד) עם תמיסת החסימה המצוינת בשלב 2.2 המכילה נוגדנים חד-שבטיים ראשוניים כנגד נוירופילמנט M (NF-M, 2H3, דילול 1/200) או גליקופרוטאין שלפוחית סינפטית 2 (SV2, דילול 1/200) כדי לסמן מסופי אקסון פרה-סינפטיים או אזורים פעילים, בהתאמה.
4. למחרת, שטפו את צרורות השרירים 3 פעמים למשך 5 דקות ב-PBS תחת תסיסה (50 סל"ד).
1. להדמיה קונפוקלית: דגרו את צרורות השרירים עם נוגדנים משניים נגד עכברים מצומדים עם פלואורופור פולט אדום (F594) (דילול 1/500) ו-α-bungarotoxin מצומד עם פלואורופור פולט ירוק (α-BTX-F488) (דילול 1/1000) ב-PBS למשך שעתיים ב-RT תחת תסיסה (50 סל"ד).
2. להדמיית דלדול פליטה מגורה (STED): דגרו את צרורות השרירים עם נוגדנים משניים נגד עכברים מצומדים עם פלואורופור פולט ירוק (F488) (דילול 1/500) ו-α-bungarotoxin מצומד עם פלואורופור פולט אדום רחוק המאופיין ביציבות פוטו גבוהה (α-BTX-F633) (דילול 1/1000) ב-PBS למשך שעתיים ב-RT תחת תסיסה (50 סל"ד).
הערה: אין לחשוף את הדגימות לאור במהלך הדגירה כדי למנוע פוטו-הלבנה.
5. שטפו את צרורות השרירים המסומנים 3x למשך 5 דקות עם PBS תחת תסיסה (50 סל"ד) והניחו אותם על שקופית עם מדיום הרכבה.
הערה: הניחו מקסימום 4 עד 5 צרורות שרירים בכל שקופית כדי לאפשר איטום.
6. הוסף כיסוי זכוכית בדרגה #1.5 (או #1.5H) (עובי 0.17 מ"מ) בחלק העליון, והנח מגנטים גליליים משני צידי המגלשה כדי להפעיל לחץ ולשטח את השרירים.
7. שמור על השקופיות מוגנות מפני O/N אור ב-4°C. אטום את השקופיות לצמיתות עם לק.
3. רכישת תמונה
1. רכישות על ידי מיקרוסקופ קונפוקלי
הערה: התמונות נאספו באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי סורק לייזר הפוך באמצעות יעד טבילת שמן בגודל 63x (HCX Plan Apo CS, צמצם מספרי 1.4 (NA)).
1. לניתוח עיוור, תן לאדם שאינו מעורב בניתוח לקודד כל שקופית עם מספר נתון. הישארו עיוורים לקבוצות הניסוי עד להשלמת הכימות של פרמטרי NMJ עבור כל הדגימות.
2. הפעל את תוכנת המיקרוסקופ במצב תצורה > >machine.xlhw.
3. הנח את השקופית על המיקרוסקופ stage ומצא את מישור התצפית בתוך הדגימה על ידי התבוננות תחת תאורת פלואורסצנטי בשדה רחב DAPI עם ערכת מסנני DAPI.
4.לחץ על פתח פרויקט > פרויקטים חדשים> וצור תיקיה לאחסון רכישת תמונות.
הערה: צור פרוייקט חדש עבור כל NMJ כדי להגביל את גודל התיקיה ולמנוע בעיות בזיכרון המחשב.
5. כדי לנהל את פרמטרי הרכישה, לחץ על חלון הכרטיסייה רכישה והגדר את חור הסיכה הקונפוקלי ל-1.0 יחידה אוורירית ועוצמת לייזר כדי לייעל את רמות הרווח וההיסט עבור הקרינה הירוקה/F488 (α-BTX) באמצעות לייזר 488 ננומטר בלוחית הקצה שיש לצלם (מצב חי מופעל).
6. לאחר מכן, מטב את רכישת הקרינה האדומה/F594 (NF-M או SV2) באמצעות לייזר המותאם לתצפית F594. במחקר זה נעשה שימוש בלייזר 552 ננומטר (מצב חי מופעל). הגדר את ספקטרום פליטת הצבע עם הטווחים הבאים עבור כל לייזר: לייזר 405 (DAPI) מ-414 עד 483 ננומטר, לייזר 488 (F488-α-BTX) מ-506-531 ננומטר, ולייזר 552 (NFM/SV2) מ-622-650 ננומטר.
7. אסוף ערימות תמונות של צמתים עצביים-שריריים בכל קבוצת ניסוי עם אותן הגדרות: גודל תמונה 1024 x 1024 פיקסלים (73.7 x 73.7 מיקרומטר) בקצב דגימה של 400 הרץ, דו-כיווני X ON, גורם זום 2.5, גודל צעד Z 0.5 מיקרומטר במצב Z-Wide.
הערה: עבור כל NMJ, מספר הפרוסות מוגדר לרכוש את כל הצומת. הגדרות הרכישה שתוארו לעיל ממלאות את משפט הדגימה של נייקוויסט-שאנון. עם זאת, המשתמש יכול ללחוץ על כפתור אופטימיזציה של פורמט, הקיים בכל תוכנות ההפעלה הקונפוקליות האחרונות, כדי להבטיח שגודל הפיקסלים וצעד ה-Z עומדים בקצב הדגימה האידיאלי של Nyquist. פעולה זו תמנע תמונות שנדגמו יתר על המידה או תת-דגימה, מה שיגרום לאובדן דיוק במדידות הנפח.
8. שמור את הקובץ המקורי ( .lif) או את תמונות מחסנית Z (.tif) בתיקייה עם שם הכולל את שם הקוד של השקופית, סוג הצביעה ומספר לוחית הקצה.
הערה: אסוף ברצף (לא בו-זמנית) את הסריקות באמצעות לייזרים של 488 ננומטר ו-552 ננומטר (F488 ו-F594) כדי למנוע דיבור צולב של הקרינה F488 לתוך ערוץ F594 ולהיפך (דימום). ניתן להגדיר את נתיב האלומה עם עוזר הצבע בתוכנת המיקרוסקופ.
9. עבור לשקופית המקודדת הבאה וחזור על שלבים 3.1.3-3.1.8 עבור כל NMJ.
10. בסוף הפגישה, לחץ על פתח במציג תלת מימד ובחר נציג NMJ של קבוצת ניסוי כדי להמחיש את התיוג התלת מימדי.
הערה: מצב תצוגה זה יעזור לוודא שפרמטרי הרכישה היו נכונים.
11. סגור את תוכנת המיקרוסקופ, נקה את המטרות עם רקמות עדשה ולאחר מכן כבה את המערכת.
2. רכישות על ידי STED microscopy
הערה: התמונות נאספו באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי לסריקת לייזר הפוך המצויד ב-STED מגודר ב-775 ננומטר באמצעות מטרת טבילה בשמן פי 100 (HC PL APO CS2 1.4 NA).
1. לניתוח עיוור, תן לאדם שאינו מעורב בניתוח לקודד כל שקופית עם מספר נתון. הישארו עיוורים לקבוצות הניסוי עד להשלמת הכימות של פרמטרי NMJ עבור כל הדגימות.
2. הפעל את תוכנת המיקרוסקופ במצב תצורה > machine.xlhw ו-STED ON.
3. לחץ על פתח פרויקט > פרויקטים חדשים כדי ליצור תיקיה לאחסון רכישת תמונות.
>הערה: צור תיקייה חדשה עבור כל שקופית כדי להגביל את גודל התיקיה ולמנוע בעיות בזיכרון המחשב.
4. הנח את השקופית על במת המיקרוסקופ וצפה בה תחת תאורה פלואורסצנטית בשדה רחב באמצעות לייזר 488 ננומטר כדי למצוא את מישור התצפית בתוך הדגימה.
5. חפש NMJ המסומן בצביעה נוירופילמנטית M (NFM) או SV2 באמצעות לייזר 488 ננומטר עם זיהוי ספקטרלי מ-506-531 ננומטר.
6. לאחר זיהוי NMJ, לחץ על הפעל STED והתחל לצבור תמונות באזור המכיל מספר קפלי צומת באמצעות לייזר 635 ננומטר עם זיהוי ספקטרלי מ-640-750 ננומטר.
>הערה: היזהר לטבלת חיפוש הרוויה במהלך רכישת התמונה ולחץ על כפתור LUT מהיר כדי למנוע חשיפת יתר (ערכי אפור >255; עבור 8 סיביות).
7. אסוף את התמונות של כל קבוצת ניסוי עם אותן הגדרות: גודל תמונה 2048 x 2048 פיקסלים (38.75 x 38.75 מיקרומטר) בקצב דגימה של 400 הרץ.
הערה: עוצמת לייזר הדלדול (STED) מוגדרת ל-65%.
8. שמור את התמונות עם שם קובץ הכולל את קוד השקופית.
הערה: אפשר ללחוץ על פורמט XY אופטימלי: הגדר פורמט כדי לקבל את הגדרת הרכישה הטובה ביותר עם הדמיית STED.
9. עבור לשקופית המקודדת הבאה וחזור על שלבים 3.2.3-3.2.8. חזור על הליך זה עבור כל השקופיות.
10. בתום הפעלת המיקרוסקופיה של STED, העבר את קובצי התמונה למחשב אחר ושמור את הקבצים המקוריים ( .lif) בכונן חיצוני או בשרת.
11. כבה את תוכנת המיקרוסקופ, נקה את המטרות עם רקמות עדשה ולאחר מכן כבה את המערכת.