הדמיה in vivo של הובלת נוזל מוחי שדרתי במוח עכבר באמצעות מקרוסקופיה פלואורסצנטית

תקציר

מקור: Sweeney, A. M., et al. הדמיה in vivo של הובלת נוזל מוחי שדרתי דרך גולגולת העכבר השלמה באמצעות מקרוסקופיה פלואורסצנטית. J. Vis. Exp. (2019)

סרטון זה מדגים את תהליך הדמיית זרימת נוזל המוח השדרתי (CSF) במוח עכבר באמצעות הדמיה פלואורסצנטית. עוקב פלואורסצנטי מוזרק לתוך בור המים (CM), ומאפשר לעקוב אחר תנועתו עם CSF דרך החללים התת-עכבישיים והפרי-וסקולריים. הדמיית זמן-lapse לוכדת את מסעו של העוקב, ומדגישה את התפשטותו לרקמת המוח דרך העורקים.

פרוטוקול

כל ההליכים הכוללים מודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ומועצת הביקורת הווטרינרית של JoVE.

1. הכנת צינורית בור המים, לוחית הראש ומחזיק הראש

1. עקר את כל המכשירים הכירורגיים ולוחות הראש לפני הניתוח.
   הערה: עוקבים פלואורסצנטיים מועברים ישירות ל-CSF באמצעות צינורית בור מים.
2. בקצרה, בעזרת נהג מחט, שברו את קצה המחט בגודל 30 גרם x 12.7 מ"מ (1/2 אינץ'), 3/4 מהדרך למטה, והניחו את הקצה הקהה של המחט לקצה אחד של צינור פוליאתילן 10 (PE10) (באורך של כ-45 ס"מ). ודא שרק השיפוע בולט מחוץ לגבול צינור PE10.
3. נתק 1/4 מהקצה המשופע של מחט 30G אחרת והנח את הקצה הקהה של המחט שנותרה בקצה השני של צינור PE10, כשמנעול הפלסטיק Luer עדיין מחובר.
4. מלאו מזרק זכוכית של 100 מיקרוליטר ב-CSF סטרילי ומלאכותי (aCSF: 126 מ"מ NaCl, 2.5 מ"מ KCl, 1.25 מ"מ NaH₂PO₄, 2 מ"מ MgSO₄, 2 מ"מ CaCl₂, 10 מ"מ גלוקוז ו-26 מ"מ NaHCO₃).
5. חבר את המזרק לקצה הקו ומלא אותו ב-aCSF עד שהוא מגיע לקצה המחט המשופעת. חשוב שהמזרק יתמלא ב-aCSF ולא באוויר, מכיוון שעמוד אוויר נוטה יותר לנפחי עירוי משתנים.
6. עבור ניסויים כרוניים, השאר את השורה מלאה ב-aCSF ודלג על שלב 1.7.
7. לניסויים חריפים, הניחו את המזרק על משאבת עירוי ומשכו כ -5 מ"מ אוויר, מה שימנע ערבוב. לאחר מכן, משוך את הנפח הכולל של העוקב/ים הרצוי לניסוי (מומלץ תוספת של 20% עקב אובדן שטח מת).
   הערה: צינור PE10 צריך להיות ארוך מספיק כדי שבועת האוויר לא תיכנס לשרוול הפלסטיק של מזרק הזכוכית בעת טעינת העוקב. עבור ניסוי טיפוסי, הפרוטוקול משתמש ב-10 מיקרוליטר של אלבומין בסרום בקר מצומד ל-Alexa Fluor 647 (BSA-647) מדולל ב-aCSF ב-0.5%.
8. ודא שלוחית הראש מתאימה למחזיק הראש ושהיא בגודל המתאים לעכבר שבו נעשה שימוש. סמנים אנטומיים כדי להבטיח זאת הם: הגבול העליון של החלון מיושר עם הקו הבין-עיני והגבול האחורי נופל על הפסגה העורפית.
   הערה: ניתן לעקר ולעשות שימוש חוזר בלוחות ראש מנירוסטה. ניתן להסיר את רוב תערובות הציאנואקרילט בעזרת תמיסת אצטון.

2. הליך כירורגי

1. שקלו והרדימו את העכבר (למשל קטמין/קסילזין; 100 מ"ג/ק"ג קטמין, 10 מ"ג/ק"ג קסילזין; i.p).
2. ברגע שהעכבר כבר לא מגיב לצביטה בבוהן, הרטיבו את הצוואר והראש במים סטריליים והתגלחו באמצעות קוצץ. לאחר גילוח האזור, נגב שוב את האזור עם ספוגית אלכוהול כדי להסיר שאריות שיער.
   הערה: הרטבת הפרווה לפני הגזירה מפחיתה באופן דרמטי את כמות השיער בחלון ההדמיה לאחר החתך.
3. הנח את העכבר במסגרת סטריאוטקטית על גבי כרית מבוקרת טמפרטורה ומרח משחת עיניים נפט על עיני העכבר כדי להבטיח שהן לא יתייבשו.
4. נקה את העור החשוף בעזרת ספוגית כלורהקסידין. לאחר 2 דקות, הסר את הכלורהקסידין בעזרת מגבון אלכוהול. לבסוף, מרחו תמיסת יוד אותה ניתן להשאיר לייבוש.
5. יש להזריק משככי כאבים תת עוריים (0.25% Bupivacaine HCl) לחלק העליון של הגולגולת והצוואר.
6. החל מחלק הצוואר המכסה את הפסגה העורפית, בצע חתך קו אמצע בעור שמעליו והמשיך בתנועה לכיוון הקו הבין-מסלולי. חתך לרוחב לגבול שבו השריר הטמפורלי נכנס לגולגולת. הסר את כל העור של חתך הפיוזיפורם כדי לחשוף את העצמות הקדמיות והקודקודיות.
   זהירות: הסינוס הרטרואורביטלי נמצא בזנב לעיניים וענפים גדולים של וריד הפנים האחורי שוכנים רוסטרל לאפרכסת. היזהר בעת ביצוע החתך כדי לחסוך מבנים אלה. אם זה קורה, הפסק את הדימום על ידי שמירה על המוסטזיס עם צמר גפן סטרילי למשך מספר דקות והמשיך.
7. השקו את הגולגולת במי מלח סטריליים ונקו את המשטח בעזרת צמר גפן כך שיהיה נקי מפסולת ושיער מכיוון שאלו יפריעו לאיכות התמונה. שקיפות הגולגולת נשמרת בצורה הטובה ביותר על ידי השארת הפריאוסטאום והפאשיה שמעליו שלמים.
   הערה: אם מבנים אלה מוסרים בטעות, הגולגולת עלולה להיות יבשה ואטומה עם הזמן. הרטיבו מחדש עם aCSF או השתמשו בתערובת של שמן פרפין וגליצרול כדי להפחית את החזרת הגולגולת בניסויים אקוטיים.
8. המשך להחדרת צינורית הבור מגנה.
9. לאחר החדרת צינורית ה-CM, יש למרוח תערובת של מלט דנטלי עם דבק ציאנואקרילט על הצד הגחוני של לוחית הראש סביב הגבול ולהניח אותה על הגולגולת כך שהגבול הקדמי של לוחית הראש יתיישר עם הקצה האחורי של עצם האף והגבול האחורי יתיישר עם ההיבט הקדמי של העצם הבין-קודקודית, לוודא שהתפר הסגיטלי (קו האמצע) ממורכז וישר ביחס לחלון (איור 1B).
10. תקן את מיקום לוחית הראש באמצעות כמה טיפות מאיץ דבק. מלא את כל הרווחים שנותרו בתערובת המלט ורפא אותה בעזרת מאיץ.
    זהירות: ודא שהציאנואקרילט אינו בא במגע עם עיני העכבר או חוסם את חלון ההדמיה.
11. הדבק את צינורית ה-CM ללוחית הראש כדי להבטיח שאלה לא יתנתקו במהלך ההובלה או כאשר העכבר מתעורר.
12. לניסויים אקוטיים, דלג לשלב 2.16.
13. לניסויים כרוניים, מרחו שכבה דקה של דבק ציאנואקרילט שקוף על הגולגולת החשופה, והקפידו לא ליצור בועות מכיוון שהן יפריעו להדמיה. הדבק מספק הגנה לגולגולת ולא יפריע להדמיה. ודא שהדבק מכסה את הגולגולת החשופה עד לעור בגבול החתך.
14. השתמש בהמוסטט clamp כדי להחזיק את צינור PE10 המלא ב-aCSF 2-3 ס"מ מה-CM וחתוך את הקו עם קצה צריבה בטמפרטורה גבוהה. לאחר ההפרדה, יש לשטח את צינור ה-PE10 המומס כדי לאטום את הצינורית.
    זהירות: הקפד לא לשחרר את המהדק עד לאחר אטימת הצינורית וודא שאין נזילות בצינור כדי למנוע פיסטולה CSF.
15. יש לתת קרפרופן (5 מ"ג/ק"ג כל 24 שעות למשך 3 ימים; תוך-צפקי [i.p.] או תת עורי [s.c.]) ולהחזיר את העכבר לכלוב מבוקר טמפרטורה חד-ביתי ולאפשר לו להתאושש לפחות 24 שעות לפני ההדמיה. אל תשאיר את העכבר ללא השגחה עד שהוא יחזור להכרה מספקת כדי לשמור על שכיבה עצם החזה. חלונות גולגולת שלמים נשארים יציבים למשך מספר שבועות. הערה: ניתן להשהות את הניסוי הכרוני כאן.
    זהירות: כמה סיבוכים לאחר הניתוח הם: צפלוהמטומה/המטומות תת-גליאליות, פיסטולה CSF וזיהום.
16. עבור ניסויים אקוטיים, הנח את העכבר לתוך מחזיק הראש באמצעות לוחית הראש כך שהגולגולת תהיה במצב קבוע. הקפידו לבדוק את רמת ההרדמה ולהניח כרית חימום מתחת לעכבר. העכבר מוכן כעת להעברה למקרוסקופ.
    זהירות: העבירו בזהירות את העכבר יחד עם משאבת העירוי על עגלה. אם צינורית ה-CM נעקרת, היא תגרום לירידה בלחץ התוך גולגולתי וכל דליפת CSF תשנה את תוצאות הניסוי.

3. הכנת העכבר להדמיה

הערה: הפרוטוקול משתנה בהתאם לשאלה אם ניסוי ההדמיה יבוצע על עכבר מורדם (התחל בשלב 3.1) או ער (התחל בשלב 3.2).

1. עכברים מורדמים
   1. הנח את מחזיק הראש על הבמה של המקרוסקופ, וודא שאין קיפולים בקו ממשאבת המזרק לצינורית CM ושהוא אינו מתוח מכיוון שהדבר עלול להשפיע על עירוי העוקב.
   2. שימו לב לקצב הנשימה ולצבע הוורוד של הריריות, המעידים על חמצון טוב. יש להזריק מי מלח תת עוריים כדי להבטיח את רמת הלחות במידת הצורך. בדוק כדי לוודא שהחיה מורדמת מספיק ומנה מחדש במידת הצורך.
   3. הפעל את מצלמת המקרוסקופ ואת הדיודה פולטת האור (LED) והתחל במצב LIVE.
   4. אשר את ההגדלה של שדה ההדמיה כך שניתן יהיה לדמיין בבירור את תפר האף בחלק העליון של השדה ואת תפר הכמבדואיד בתחתית, כאשר התפר הסגיטלי מקביל וממורכז במרכז התמונה (איור 1C). לאחר שנמצא במקומו, אבטח את מחזיק הראש למקרוסקופ stage בעזרת סרט.
   5. מקדו את המקרוסקופ בגולגולת החשופה. למרות שלמקרוסקופים יש עומק שדה גדול יחסית, העקמומיות של גולגולת העכבר מאפשרת רק לאזור ספציפי להיות בפוקוס. התוצאות הטובות ביותר מתקבלות כאשר מישור המוקד ממוקם בצדדים הצדדיים של העצמות הקודקודיות מאחורי התפרים העטרתיים.
      הערה: זהו המיקום של עורקי המוח האמצעיים (MCA), שם מתרחשת רוב זרימת CSF (איור 1D, E).
2. עכברים ערים
   1. לפני סשן ההדמיה, תנו לבעלי החיים להתאושש לפחות 24 שעות מניתוח לוחית הראש. מומלץ גם תקופות החלמה ארוכות יותר (5-7 ימים). במהלך תקופה זו, אמן את העכבר להיות מקובע עם הראש על הבמה בצינור הריסון למשך 0.5-1 שעה ביום למשך תקופת ההחלמה.
      הערה: הרגלה מאפשרת לחבר את העכבר למחזיק הראש ללא הרדמה ומפחיתה מתח וחרדה במהלך הניסוי בפועל. אם זה לא אפשרי וההרדמה אינה מפריעה לניסוי, ניתן להשתמש במינון אינדוקציה של חומר הרדמה בשאיפה (למשל, איזופלורן 2% בקצב זרימה של 1-2 ליטר לדקה O2) כדי לחבר במהירות את העכבר לשלב הראש.
   2. לאחר שהעכבר מקובע למחזיק הראש ובצינור הריסון, בצע את שלבים 3.1.1-3.1.5.

4. עירוי של עוקבי CSF פלואורסצנטיים

1. Acute CM Cannulation
   1. מכיוון שהעוקב כבר הועמס לתוך הצינורית לפני שהוכנס לבור המים בשלב 1.6, הגדר את משאבת העירוי לקצב ולנפח הרצויים. פרדיגמות עירוי המשמשות באופן שגרתי הן 5-10 מיקרוליטר ב-1-2 מיקרוליטר לדקה, אך ניתן להתאים פרמטרים אלה בהתאם לניסוי המסוים, או לגודל וגיל החיה.
2. קנולציה כרונית של CM
   1. לפני תחילת סשן ההדמיה, בצע את שלבים 1.2-1.7 לניסויים חריפים להכנת קו העירוי להעברת העוקבים.
   2. לאחר הכנת הקו, בעזרת מהדק המוסטט חותכים את הקצה האטום של צינורית ה-CM הכרונית. קח את המחט מהקו שהוכן בשלב 4.2.1 והכנס אותה בעדינות לצינורית. שחרר את המהדק והשתמש במשאבת המזרק, קדם את עוקב ה-CSF בקצב העירוי הרצוי (למשל, 2 מיקרוליטר לדקה) לניסוי עד שהעוקב יגיע למחט המושתלת ב-CM.
      זהירות: אם המחט חודרת דרך הצינור בעת חיבור הקו, הסר את המחט, חתוך את הקטע המנוקב וחזור על שלב זה. כל קרע בצינור PE10 יגרום לדליפה וישפיע על תוצאות הניסוי.

5. הגדרת מפגש ההדמיה

1. בהתבסס על העוקב הפלואורסצנטי המוחדר, קבע את אורך גל העירור ואת זמן החשיפה עבור כל ערוץ. בחר את זמן החשיפה הקצר ביותר הדרוש כדי לדמיין את העוקב על מנת למקסם את הרזולוציה הזמנית של הדמיית זמן-lapse. זמן חשיפה זה ישמש לכל הניסויים הבאים שמטרתם להשוות את הובלת CSF בין בעלי חיים שונים.
   הערה: טיפ אחד הוא להשתמש בעוקב בקו CM כדי להתאים את זמן החשיפה. למרות שזו גישה ראשונה שימושית, יש למטב אותה לאורך זמן.
2. בחר את משך הניסוי ואת המרווחים שבהם יירכשו התמונות. ניסויים נמשכים בדרך כלל בין 30-60 דקות, תלוי באיזה שלב של הובלה גלימפטית מעניין. קצבי פריימים של פריים אחד לדקה ומהירים יותר מספיקים לרוב הניסויים.
3. הגדר את שם הקובץ ואת ספריית השמירה.
4. אם ההדמיה תיאסף בנוסף לרכישה בו זמנית של משתנים אחרים (למשל, אלקטרוקרדיוגרמה, לחץ דם עורקי, אלקטרופיזיולוגיה), ניתן לתכנת את המקרוסקופ והמשאבה כך שיופעלו באמצעות תוכנת איסוף נתונים. בדוק שפונקציית ההפעלה במקרוסקופ נכונה לפני המעבר לשלב הבא.

6. ניסוי הדמיה אופטית טרנס-גולגולתית

1. התחל את עירוי העוקב ואת ההדמיה בו זמנית.
2. בדוק באופן שגרתי את צינורית ה-CM ואת צינור PE10 לאיתור סימנים לדליפה. אם יש עוקב כלשהו שדולף ב-CM, יש לשלול את התוצאות מניסוי זה.
   הערה: אם העוקב מתחיל להצטבר במוח הקטן ואינו עובר במסלול הגלימפטי של עורקי המוח האמצעיים (MCA), סביר להניח שצינורית ה-CM הוזרקה למוח הקטן. אין לכלול נתונים אלה.
3. לניסויים אקוטיים, לאחר סיום הניסוי, הוציאו את העכבר מהמיקרוסקופ ובדקו שהוא עדיין מורדם כראוי. ערפו במהירות את ראשו של העכבר וקצרו את רקמת המוח. טבילה-תקן את המוח ב-4% פרפורמלדהיד (PFA) למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס.
   1. עבור ניסויים כרוניים, לאחר השלמת ההדמיה, הסר את קו ה-CM מהצינורית, שטוף עם aCSF סטרילי ואטום מחדש את צינורית ה-CM עם קצה צריבה בטמפרטורה גבוהה. הסר את העכבר ממעמד הראש והחזיר אותו לכלוב שלו. חזור על תהליך זה עד שלא תידרש הדמיה נוספת ולאחר מכן בצע את שלב 6.3.

תוצאות

איור 1. הדמיה מקרוסקופית טרנס-גולגולתית. (A) סכמטי של מערך ההדמיה המקרוסקופית. (B) מבט גבי על מיקום לוחית הראש על הגולגולת. העצם הבין-קודקודית ועצמות האף, הקדמית והקודקודית נראות כולן. (C) ג...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
0.25% Bupivacaine HCl			University of Rochester Vivarium
100 μL מזרק אטום לגז דגם 1710 TLL, PTFE Luer Lock	Hamilton Company	81020
A-M Systems אבקת	צמנט דנטליפישר סיינטיפיק	NC9991371
קרפרופן			אוניברסיטת רוצ'סטר Vivarium
Chlorhexidine	Prevantics	B10800
CMOS מצלמה	Hammamatsu	ORCA פלאש 4.0
צלחת ראש	אוניברסיטת רוצ'סטר	אין קטלוג #	בהתאמה אישית בחנות המכונות באוניברסיטת רוצ'סטר
מאיץ בטמפרטורה גבוהה	Bovie Medical Corporation	AA01
Insta-set Bob	Smith Industries	BSI-151
Isoflurane - Fluriso	Vet One	502017	אוניברסיטת רוצ'סטר Vivarium
Ketamine			Strong Memorial Hospital Pharmacy
Krazy Glue	Elmer's Products, Inc	אין קטלוג #, ראה קישור בתגובות	https://www.amazon.com/Krazy-Glue-KG48348MR-Advance-Multicolor/dp/B000BKO6DG
קלטת כירורגית Micropore	Fisher Scientific	19-027-761
Paraformaldehyde	Sigma-aldrich	P6148
PE10 - פוליאתילן .011 אינץ' x .024 אינץ' לכל רגל, 100 רגל רציף	Braintree Scientific	PE10 100 FT
משאבה 11 עירוי עלית בלבד מזרק כפול	מכשיר הרווארד	70-4501
PURALUBE VET OINTMENT	Dechra
Puritan PurSwab מקלות ניקוי כותנה עם קצה	פישר סיינטיפיק	22-029-553
מחקר מיקרוסקופ זום מאקרו	אולימפוס	MVX10
צלחת מחזיק ראש פשוטה (לעכברים)	Narishige בינלאומי ארה"ב בע"מ	MAG-1
מחטים לשימוש חד פעמי, BD רפואי	VWR	BD305106
רפידות הכנה לאלכוהול סטריליות	פישר סיינטיפיק	22-363-750
LED מתכוונן PRIOR	לומן 1600-LED
קסילזין			אוניברסיטת רוצ'סטר Vivarium