השתלה דרך האף של תאי מיקרוגליאה אנושיים שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים למוח העכבר

תקציר

מקור: Parajuli, B., et.al. השתלת מיקרוגליה שמקורה בתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים במוחם של עכברים בעלי יכולת חיסונית באמצעות נתיב טרנס-אף לא פולשני. J. Vis. Exp. (2022).

סרטון זה מדגים את ההשתלה הטרנס-אף של תאי מיקרוגליה אנושיים (iPSMG) שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים למוח עכבר. היאלורונידאז מוחל על הנחיריים של עכבר מדולדל מיקרוגליה כדי לשפר את החדירות. תרחיף iPSMG ניתן דרך האף, והעכבר רשאי להתאושש. מדיה עשירה בגורמי גדילה ניתנת באופן קבוע כדי לתמוך בהישרדות iPSMG ברקמת המוח.

פרוטוקול

כל ההליכים הכוללים מודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ומועצת הביקורת הווטרינרית של JoVE.

1. הכנת מדיום תאים, מדיום השתלה ותערובת הרדמה

1. הכן את מדיום התא על ידי הוספת 10% סרום בקר עוברי ו-0.1% פניצילין/סטרפטומיצין במדיום הנשר השונה של Dulbecco (DMEM).
2. הכן את מדיום ההשתלה על ידי הוספת גורם מגרה מושבה אנושית 1 או hCSF1 (250 ננוגרם/מ"ל) וגורם גדילה טרנספורמטיבי אנושי בטא 1 או hTGF-β1 (100 ננוגרם/מ"ל) למדיום התא.
3. הכן את תערובת ההרדמה להזרקה תוך צפקית על ידי ערבוב של 0.45 מ"ל של מדטומידין הידרוכלוריד, 1.2 מ"ל של מידזולם ו-1.5 מ"ל של בוטאורפנול טרטרט ב-11.8 מ"ל של מי מלח רגילים.

2. הכנת תאי מיקרוגליה אנושיים (iPSMG) שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים

הערה: iPSMG קפוא (טבלת חומרים) נשמר בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס עד לשימוש.

1. מפשירים את התאים הקפואים במהירות באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס. סובבו את הדגימות עד שכל הקרח הנראה לעין נמס.
2. הוסף את המיקרוגליה האנושית שמקורה בתאי גזע פלוריפוטנטיים מופשרים (iPSMG) למצע התרבות המחומם ל-37 מעלות צלזיוס. הוסף 1 מ"ל של תאים מופשרים המכילים מדיום (1 × 10 6 תאים) ל-10 מ"ל של מצע התרבית.
3. צנטריפוגה של התאים ב-300 x גרם למשך 5 דקות כדי להשיג כדור תא.
4. לאחר צנטריפוגה, הסר את כל הסופרנטנט מבלי להפריע לכדורית התא. הסרה מלאה של סופרנטנט רצויה כדי להפחית את דילול ריכוז הציטוקינים במדיום ההשתלה.
5. הוסף את מדיום ההשתלה כדי לקבל ריכוז תאים של 1 x 10⁵ תאים/מיקרוליטר.
6. הניחו את ה-iPSMG על קרח והמשיכו מיד להשתלה.
   הערה: הכנת iPSMG להשתלה מתבצעת על ספסל נקי כדי למנוע זיהום.

3. הכנת העכבר להשתלה דרך האף (Tsn)

1. האכילו את העכברים הזכרים מסוג הבר (C57BL/6J, בני 8 שבועות) בתזונה המכילה PLX5622 למשך 7 ימים.
2. בסוף היום השביעי, יש להפסיק את דיאטת ה-PLX ולהאכיל את העכברים בתזונה רגילה עד סוף המחקר.
   הערה: PLX5622 מכינים דיאטה המכילה על ידי הוספת 1.2 גרם PLX5622 ב-1 ק"ג AIN-93G (טבלת חומרים).

4. השתלה דרך האף של תאים

1. 24 שעות לאחר הפסקת האכלת PLX, שקלו את העכברים והרדימו אותם באמצעות הזרקה תוך-צפקית של תערובת ההרדמה (0.2 מ"ל/20 גרם).
2. לאחר שהעכברים מורדמים לחלוטין כפי שהוערך על ידי חוסר תגובה לרפלקס נסיגת הדוושה (צביטת בוהן מוצקה), יש לתת 2.5 מיקרוליטר של היאלורונידאז בתמיסת מלח פוספט (PBS) (100 U/mL), שעה אחת לפני השתלה דרך האף של iPSMG לכל נחיר פעמיים באמצעות קצה פיפטה של 10 מיקרוליטר כדי להגביר את החדירות של רירית האף.
3. לאחר מריחת היאלורונידאז, הניחו את העכברים במצב שכיבה.
4. חזור על שלב 4.2 10 דקות לפני השתלת iPSMG דרך האף.
5. מרחו 2.5 מיקרוליטר של תרחיף תאים לנחיר אחד של העכבר באמצעות קצה פיפטה של 10 מיקרוליטר.
6. הנח את העכבר במצב שכיבה למשך 5 דקות לפני מתן תרחיף התאים לנחיר השני.
7. חזרו על שלבים 4.5 ו-4.6 ארבע פעמים, תוך שימוש בנפח כולל של 20 מיקרוליטר לכל חיה.
8. הנח את העכבר במצב שכיבה על כרית חום של 37 מעלות צלזיוס עד להתאוששות מההרדמה.
9. לאחר 48 שעות לאחר הפסקת האכלת PLX, חזור שוב על שלבים 4.1-4.7 על אותם עכברים.
   הערה: יש לציין שתאי iPSMG מונחים על קרח במהלך ההשתלה.

5. מריחת ציטוקינים

1. להרדמת העכברים על ידי הזרקה תוך-צפקית של תערובת הרדמה (0.2 מ"ל/20 גרם).
2. מרחו 2.5 מיקרוליטר ממדיום ההשתלה לנחיר אחד של העכבר באמצעות קצה פיפטה של 10 מיקרוליטר.
3. הנח את העכבר במצב שכיבה למשך 5 דקות לפני מתן אמצעי ההשתלה לנחיר השני.
4. חזור על שלבים 5.2 ו-5.3 ארבע פעמים, תוך שימוש בנפח כולל של 20 מיקרוליטר לכל בעל חיים.
   הערה: יש לציין כי מתן דרך האף של מדיום השתלה (ציטוקינים אנושיים) נדרש כל 12 שעות לכדאיות של iPSMG מושתל עד סוף המחקר.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Thermo Fisher Scientific	10566
AIN 93G	Oriental Yeast Co
סרום בקר עוברי	GE Healthcare מדעי החיים	SH30070.03
קפוא iPSMG	Shionogi & Co., Ltd		מעבדה לגילוי תרופות וחקר
מחלות גורם מגרה מושבה אנושית 1 (hCSF1)	PeproTech	300-25
Hyaluronidase	Sigma-Aldrich	H-3506
Medetomidine hydrochloride	Meiji Seika	VETLI5
Midazolam	Astellas	18005A2
Paraformaldehyde	Wako Pure Chemical Industries	162-16065
פניצילין/סטרפטומיצין	תרמו פישר סיינטיפיק	15140-122
פיפטה	אפנדורף	3120000011
קצה פיפטה	אפנדורף	30076028
PLX5622	Amadis Chemical	A930097
גורם גדילה טרנספורמטיבי-β1 (Tgf-b1)	PeproTech	100-21